РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 310-317
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИНДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗА ПОД ВЛИЯНИЕМ АКРИДОНУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ И НОВЫХ ЕЕ СОЕДИНЕНИЙ С ПЕПТИДАМИ - САНОГЕНОМ
И ТИМОГЕНОМ
© 2009 г. Ф.Ю. Гариб***, Т.В. Миронова*, Т.П. Оспельникова*, А.П. Ризопулу, З.А. Ардемасова***, В.Н. Калихевич***, Ф.И. Ершов*
*НИИэпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия;
**Российская медицинская академия последипломного образования, Москва, Россия;
***Санкт-Петрбургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Поступила: 13.09.2009. Принята: 01.10.2009
При одновременном введении мышам синтезированного нами оригинального трипеп-тида саногена и акридонуксусной кислоты (АУК) обнаружен выраженный синергизм в индукции «раннего» и «позднего» эндогенного интерферона, обладающего высокой противовирусной активностью. Показано, что известный дипептидный иммуномодулятор тимоген, состоящий из глутаминовой кислоты и триптофана, индуцирует продукцию ин-терферонов со значительной противовирусной активностью в системах in vitro и in vivo. Новый низкомолекулярный препарат ТАУК, синтетизированный на основе глутамил-трип-тофана и акридонуксусной кислоты, является перспективным индуктором интерферона с повышенной противовирусной активностью, что выявлено в экспериментах с мышами и клетками крови людей.
Ключевые слова: индукторы интерфероногенеза, интерферон, синергизм, акридонук-сусная кислота, тимоген
ВВЕДЕНИЕ
Интерфероны (1Р№) являются важной составляющей иммунного ответа и обеспечивают защиту хозяина против вирусных и бактериальных патогенов, а также имеют значение в уничтожении опухолевых клеток, что привело к использованию этих протеинов и их индукторов в клинической практике. 1Р№ являются мультигенным семейством индуцибельных цитокинов, организованных в единую систему [ 1 — 4]. Так, связывание 1Р№ I типа со специфическим рецептором — ¡РЫЛИ (см. ниже), приводит к последующей стимуляции более 300 генов [5].
Начиная с открытия интерферонов отмечается значительный прогресс в описании цитокинов как таковых, сигнальных путей,
Адрес: 119421, г. Москва, ул. Обручева, 24—121. E-mail: f.garib@yandex.ru
которые направляют противовирусный ответ клетки. Исследования на генном уровне выявили четыре основных эффекторных фермента, на которые оказывают влияние 1Р№: Мх ГТФаза, 2'-5'-олигоаденилат-синтаза-на-правленная рибонуклеаза Ь, протеинкиназа И и КС15 — убиквитин-подобный энзим. Они блокируют транскрипцию вируса, разрушают вирусную РНК, подавляют трансляцию и модифицируют функцию белков, таким образом, контролируя все этапы репликации вируса.
Идентифицировано три типа 1Р№, которые классифицируются по рецепторам, проводящим сигнал. Функция 1Р№ I типа хорошо охарактеризована и является основной в противовирусном ответе хозяина. 1Р№ I типа у человека имеют гены, которые включают 1РЫа (13 подтипов), 1РЫр, 1РЫк, 1РЫе, 1РЫо, ¡РЫт и 1РЫ8; они взаимодействуют с 1РЫа-ре-цепторным комплексом (¡РЫЛИ), состоящим из двух компонентов: ¡РЫЛИ! и 1РЫЛИ2. 1Р№
II типа представлены единственным IFNy, который связывается с рецепторным комплексом IFNGR и опосредует ответ на патогены, отличающиеся от вирусов. Недавно описан IFN III типа — IFNA,, имеющий три генных продукта, которые передают сигнал через комбинацию рецепторов IFNLR1 и IL-10R2. Основной функцией IFNA, является регуляция противовирусного ответа [1, 6].
Немногие из рецепторов клеток млекопитающих непосредственно вовлечены в противовирусный иммунный ответ. Многие из генных продуктов кодируют паттерн-рас-познающие рецепторы (PRRs). В частности, Toll-подобные рецепторы (TLRs) -3, -7 и -8 распознают вирусные молекулы и модулируют сигнальные пути или транскрипционные факторы, которые усиливают продукцию IFNs и защищают клетки от вируса. Фрагменты нуклеиновых кислот патогенов, такие как ssRNA, действуют через TLR-7 и TLR-8, а бактериальные олигодеоксирибонуклеотиды через TLR-9 и являются потенциальными индукторами продукции IFNs [7 — 9]. Наиболее изучен механизм индукции интерфероно-генеза 2-нитчатой РНК и ее синтетического аналога poly(I:C). TLR3 распознает эти лиган-ды и под их влиянием в клетках синтезируются IFN I типа, провоспалительные цитокины и хемокины, а также созревают дендритные клетки, активируются NK и цитотоксические лимфоциты, т.е. индуцируются не только врожденные, но и адаптивные иммунные реакции против вирусов [10]. Сегодня poly(I:C) позиционируется рядом фармацевтических компаний как мощный индуктор интерферо-ногенеза.
Другие индукторы интерферона изучены менее детально и используются в медицине по тем же показаниям, что и poly(I:C): amyxin, amizon, anandin, arbidol, blasten, cycloferon, galavit, groprinosine, hepon, immunoxel, dzherelo, kagocel, larifan, ligfol, mebavin, MIGI-KLP, V-5 Immunitor, SCV-07, milife, neovir, poludan, ragocin, ridostin и savratz. Большинство из них исследовано и внедрено в клиническую практику в России [11].
Подобно любому биологическому процессу, синтез IFNs является контролируемым. Поэтому, вслед за его индукцией и синтезом наступает фаза гипореактивности (рефрак-терности), когда повторные стимулы того же индуктора не имеют эффекта. Такая ситуация может способствовать дальнейшей репликации вирусов и препятствовать лечебному
действию индукторов 1Б№. Вероятным выходом из этой ситуации является использование другого индуктора, имеющего иной механизм действия, чем исходный индуктор [1].
На наш взгляд, перспективным подходом может быть использование эффекта синергизма, когда одновременное введение двух индукторов с разными механизмами действия резко усиливает и, что весьма существенно, пролонгирует период циркуляции интерфе-ронов в кровотоке [12].
Известно, что индукторы 1Б№ обладают им-муноактивными свойствами, что послужило причиной включения их в группу иммуномо-дуляторов [1]. Однако остается недостаточно изученным обратный тезис: обладают ли им-муномодуляторы противовирусным действием, опосредованным через систему 1Р№? В частности, к типичным иммуномодуляторам относятся нативные и синтетические пептиды тимической природы — тимоген [13, 14], в связи с чем представлялось интересным оценить его способность индуцировать интерфе-роногенез.
Индукторы интерферона все шире внедряются в клиническую практику и накопленный успешный опыт их применения в нашей стране и за рубежом ставит задачу по синтезу новых перспективных индукторов 1Б№ для их дальнейшего изучения и внедрения. Классическим индуктором 1Б№ является акридо-нуксусная кислота [1], в связи с чем, мы полагаем, что ее низкомолекулярные соединения с иммуномодуляторами пептидной природы могут стать новым классом индукторов медицинского назначения.
Цель работы — оценить противовирусное интерфероногенное действие новых соединений акридонуксусной кислоты с дипептидом тимогеном и трипептидом саногеном.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованные препараты
Акридонуксусная кислота (АУК) — классический активный низкомолекулярный индуктор эндогенного интерферона, относящийся к классу акридонов, является субстанцией фармакопейных препаратов циклоферона и неовира. В наших исследованиях препарат использовался в качестве позитивного контроля; тимоген — а-глутамил-триптофан: синтетический аналог фрагмента тимусного пептида, известное иммуномодулирующее средство; саноген — оригинальный синтети-
ческий трипептид, состоящий из аминокислотных остатков триптофана и глутаминовой кислоты, обладает иммуностимулирующим и противовоспалительным действием; САУК — оригинальное синтетическое соединение, состоящее из саногена и остатка АУК; ТАУК — оригинальное синтетическое соединение, состоящий из остатков глутаминовой кислоты, триптофана и остатка АУК.
Исследования выполнены в соответствии с «Методическими указаниями по изучению специфической активности интерферонов и индукторов интерферона» [15].
Оценка индукции интерферона и антивирусного действия в системе in vivo
Использованы белые беспородные лабораторные мыши с массой тела 18 — 20 г, которым вводили внутримышечно однократно: ТАУК (2 мг/кг), тимоген (4 мкг/кг), саноген (4 мкг/ кг), САУК (2 мг/кг) или натриевую соль ак-ридонуксусной кислоты (АУК) (2 мг/кг) в объеме 0,2 мл. Сыворотку получали после декапитации мышей (с учетом требований гуманного отношения к животным) через 4, 24, 48 и 72 ч после введения препаратов. Для каждой пробы использовано по 6 мышей. Титрование сывороток проводили по подавлению цитопатического действия тест-вируса на перевиваемой культуре фибробластов легких эмбрионов мышей L929. Для этого в плоскодонные полистироловые планшеты с монослоем фибробластов вносили разведенные сыворотки (от 1:20 и выше ) по 100 мкл. Планшет инкубировали 24 ч (37 °С, 5% СО2), надосадок удаляли, в лунки вносили вирус энцефаломиокардита мышей (штамм «Колумбия») в количестве, вызывающем цито-патогенное действие 100% фибробластов. Конечный объем среды в лунке составил 100 мкл. Планшет инкубировали 24 ч (37 °С, 5% СО2). За титр противовирусной активности принимали максимальное разведение сыворотки, которое защищало 50% фибробластов от цитодеструктивного действия вирусов и выражали в интерфероновых единицах (ИЕ) на пробу.
Оценка индукции интерферона и антивирусного действия в системе in vitro
В образцы крови здоровых лиц вносили препараты, разведенные в среде для культивирования клеток. Инкубировали 4 и 24 ч (37 °С, 5% СО2). Надосадочную жидкость титровали на противовирусную активность, как описано
выше, с тем отличием, что использовали перевиваемую линию фибробластов человека.
В исследованиях in vitro препараты вносили в культуру клеток крови здоровых доноров до конечной концентрации 100 нг и 1000 нг (1 мкг) в 1 мл культуры. Ранее выявлено, что сами препараты в исследуемых концентрациях не оказывают цитопатического действия на клетки.
Используя значения активности интерферона при раздельном и сочетанном введении препаратов, можно количественно определить индекс синергизма (Ис) по формуле: Ис = А:(Б + В), где: А — фактическая продукция интерферона под влиянием сочетанного введения препаратов Б и В.
РЕЗУЛЬ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.