ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28.017.7
ИНДУКЦИЯ ПРОГРАММИРОВАННОГО ЛИЗИСА КУЛЬТУРЫ STREPTOMYCES LIVIDANS ИНГИБИТОРАМИ СЕРИН-ТРЕОНИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ТИПА
© 2012 г. О. Б. Беккер*, 1, Д. А. Мавлетова*, И. К. Любимова*, Т. А. Мирончева*,
А. А. Штиль***, В. Н. Даниленко*
*Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва **Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН, Москва Поступила в редакцию14.03.2011 г.
Описано явление программированной гибели (ПГ) клеток мицелия Streptomyces lividans — отсроченного лизиса при действии производных индолилмалеимидов — ингибиторов серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) актинобактерий. Отсроченный лизис мицелия сопровождается нарушением целостности ДНК, подобно феномену, установленному для ПГ дифференцирующегося мицелия S. lividans. Методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии идентифицированы белки, накапливающиеся в процессе ПГ. Большинство этих белков известны как стресс-индуцируемые. Модель отсроченного лизиса актинобактерий при ингибировании СТПК позволяет установить молекулярные механизмы особого вида ПГ прокариот и использовать эти механизмы в терапевтических целях.
Ключевые слова: актинобактерии, отсроченный лизис, программированная гибель, серин-треони-новые протеинкиназы, ингибиторы.
Программированная гибель (ПГ) — апоптоз, описана в культурах клеток человека и других эу-кариот [1, 2]. В последние годы выявлены механизмы гибели клеток бактерий, в той или иной степени схожие с апоптозом эукариот [3—5]. У прокариот обнаружены гомологи генов эукариот, продукты которых участвуют в инициации и реализации ПГ клеток [6]. У бактерий, как и у многоклеточных, можно найти примеры программированной гибели клеток. Например, автолиз материнской клетки при споруляции, в котором принимают участие белки — автолизины [5], или отмирание вегетативных клеток при образовании плодового тела у миксобактерий [3].
У бактерий имеются специальные модули — системы "токсин—антитоксин" [6]. В сбалансированных условиях роста бактерий токсин постоянно обезвреживается антитоксином; однако при некоторых изменениях метаболизма (аминокислотное голодание и др.) равновесие нарушается и токсин "отравляет" клетку. В результате рост части клеток популяции останавливается, что позволяет выжить остальным бактериям [7].
Явление, подобное программируемому самоубийству, наблюдается также при дифференци-ровке актинобактерий, в частности, стрептоми-цетов [3, 4, 8, 9]. У Streptomyces antibioticus через 8—
1 Автор для корреспонденции (e-mail: obekker@yandex.ru).
10 ч после высева спор на агаре происходит лизис большинства сегментов гиф; оставшиеся интакт-ными сегменты дают начало воздушному мицелию, растущему вертикально над поверхностью агара. Спустя 25 ч происходит второй "раунд" гибели гиф, в результате чего воздушный мицелий "прореживается", и через 48—96 ч начинается споруляция. В эти процессы смены типов мицелия вовлечены механизмы, сходные с теми, которые опосредуют апоптоз у эукариот, в частности, осуществляющийся с участием серин-треонино-вых, Са2+-зависимых протеинкиназ СТПК [10]. Изучение механизмов и индукторов "программированного лизиса" бактериальных клеток представляет научный и практический интерес.
Известно участие серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) в индукции апоптоза клеток человека [11]. Выявлены селективные индукторы апоптоза — ингибиторы СТПК [12]. Поэтому поиск агентов, индуцирующих гибель клеток прокариот путем воздействия на сигнал-передающие системы, является вполне логичным и перспективным.
СТПК эукариотического типа идентифицированы у всех актинобактерий, включая патогенные виды микобактерий [13]. Эти ферменты опосредуют важнейшие свойства фенотипа — вирулентность, патогенность, лекарственную устойчивость, персистирование [14] и рассматриваются
как потенциальные биомишени при создании новых поколений лекарств.
Цель настоящей работы — исследовать возможную роль СТПК в индукции "программированного лизиса" клеток модельного штамма Streptomyces lividans.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Штамм Streptomyces lividans ТК24 (66) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez? Db=genome&Cmd=ShowDetailView&Term-ToSearclT=6276].
Среды. Для выращивания штамма S. lividans использованы среды YSP, YEME [15] и МГ [16]. Реактивы приобретены в фирме "Sigma" (кроме особо оговоренных случаев).
Ингибиторы СТПК класса индолилмалеими-дов, используемые в настоящей работе, в том числе: L-I, L-II, L-III, L-IV (табл. 1) — впервые синтезированы в лаборатории химической трансформации антибиотиков НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН и предоставлены М.Н. Преображенской.
Тестирование ингибиторов СТПК. Отбор потенциальных индукторов ПГ среди ингибиторов СТПК производился следующим образом: чашки Петри с агаризованной средой МГ заливали полужидким агаром со споровой суспензией культуры S. lividans; после застывания агара на его поверхность накладывали бумажные диски, пропитанные раствором исследуемого соединения; чашки Петри инкубировали в течение 20 ч при 28°С. На выросшем газоне фиксировали зону ингибирования роста (гало) вокруг бумажного диска и продолжали инкубировать в течение последующих 24 ч. Затем фиксировали величину зоны лизиса культуры вокруг зоны первичного подавления роста. Все тестируемые вещества наносили на диски в количестве 1000 и 2000 нмоль (табл. 1).
Действие ингибиторов СТПК на мицелий акти-нобактерий при росте на агаризованной среде.
Штамм S. lividans выращивали на чашках Петри с агаризованной средой YSP при 28°С в течение 48 ч, используя в качестве подложки нитроцеллюлозу Hybond ("Amersham"). Нитроцеллюлоз-ные диски, с выросшем на них мицелием, переносили в чашки Петри, содержащие агаризован-ную среду МГ с добавлением ингибиторов СТПК и без них. Чашки инкубировали 24 ч до обнаружения частичного лизиса субстратного мицелия на среде с добавлением ингибитора СТПК [9]. Затем мицелий контрольных (без ингибитора СТПК) и опытных вариантов собирали шпателем, переносили в центрифужные пробирки и промывали
трехкратно в растворе 1 М трис-HCl, центрифугируя при 10000 g. Полученные образцы использовали для выделения ДНК.
Действие ингибиторов СТПК на мицелий акти-нобактерий в жидкой среде. Штамм S. lividans выращивали при 28°С в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл среды YEME на шейкере (250 об/мин) в течение 20 ч. В выросшую культуру в ранней логарифмической фазе роста добавляли раствор ингибитора СТПК в исследуемой концентрации и проводили культивирование (15 ч). Мицелий S. lividans собирали центрифугированием (5000 g, 20 мин) и использовали для электро-форетического анализа белков. В контрольных вариантах мицелий S. lividans выращивали в отсутствие ингибитора СТПК.
Выделение тотальной ДНK S. lividans проводили методом, изложенным в руководстве [15]. ДНК была выделена из мицелия не подвергавшегося автолизу. Целостность молекул ДНК определяли электрофорезом в 0.9% агарозном геле [9].
Гель-электрофорез белков. Для протеомного анализа белков S. lividans мицелий трижды отмывали в 1.5 мл 0.1 М трис-НС1, рН 7.5. Клетки ли-зировали в 1.5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgC12, 5 мМ 2-мер-каптоэтанола, 10% глицерина, 1 мМ фенилметил-сульфонилфторида), в который вносили лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл. Мицелиаль-ную суспензию инкубировали 1 ч при 37°С и постоянном перемешивании. Лизаты обрабатывали ультразвуком с частотой 22 кГц, трижды по 15 с, с интервалом между обработками 30 с (Branson Digital 250). Клеточные обломки осаждали центрифугированием (14 000 g, 20 мин, 4°С), белки супернатанта (экстракты) осаждали пятью объемами ацетона, перерастворяли в буфере, содержащем 10% глицерина, 5% бета-меркаптоэтано-ла, 2.3% SDS, 0.0625 М тpис-HC1 (рН 6.8) и проводили электрофорез в 12% полиакриламидном геле [17]. Гели фиксировали в растворе, содержащем 50% этанола и 10% СН3СООН и окрашивали CBB-G 250. Концентрацию белка определяли по методике Брэдфорд [18].
Двумерный белковый гель-электрофорез. Суммарные белки лизированного мицелия разделяли двумерным изоэлектрофокусированием по методу О'Фаррела с небольшими модификациями [19]. Триптический гидролиз белков в полиакриламидном геле и подготовку образцов для масс-спектрометрии проводили по методике, рекомендованной фирмой "Promega" (In Gel Digest Protocol), масс-спектры получены методом, рекомендованным фирмой "Bruker Daltonics" на аналитическом масс-спектрометре Bruker Daltonics
ИНДУКЦИЯ ПРОГРАММИРОВАННОГО ЛИЗИСА КУЛЬТУРЫ Таблица 1. Индукция вторичного лизиса клеток S. lividans ингибиторами СТПК
Ингибиторы СТПК серии LCTA
Формула
Экспериментальная концентрация, нмоль/диск
Зона
ингибирования через 20 ч роста, мм
Зона вторичного лизиса, мм
II
III
IV
10
12
34
1000
13
33
1000
13
40
2000
14
14
N-
(UltrafleXtreme Maldi Tof/Tof MS) в отделе про-теомных исследований НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI (подбазы — Streptomy-ces coelicolor, Streptomyces lividans).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ранее мы разработали клеточную тест-систему S. lividans aphVIII+ для отбора in vivo ингибиторов СТПК эукариотического типа [20]. Ключевым элементом тест-системы является аминоглико-зидфосфотрансфераза, тип VIII (AphVIII) — фер-
Рис. 1. Действие ингибитора СТПК на культуру S. lividans^. а — зоны ингибирования роста газона S. lividans через 20 ч культивирования в присутствии ингибитора СТПК L-Ш, нанесенного на бумажные диски; б — зоны вторичного лизиса бактерий через 44 ч культивирования.
мент, инактивирующий аминогликозидные антибиотики. Активность AphVIII регулируют СТПК, поэтому фосфорилирование фермента увеличивает устойчивость S. lividans к аминогликозидным антибиотикам, а ингибиторы СТПК повышают чувствительность бактерий к аминогликозидам. Количественная оценка чувствительности S. liv-idans к канамицину при действии ингибиторов СТПК позволяет проводить первичный отбор ингибиторов. С помощью указанной тест-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.