БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 3, с. 365 - 372
УДК 777.352.42
ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ
Обзор
© 2010 г. М.В. Ковалёва, Е.И. Суханова, Т.А. Тренделева, К.М. Попова, М.В. Зылькова, Л.А. Уральская, Р.А. Звягильская*
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33; факс: (495)954-2732, электронная почта: renata_z@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 07.08.09 После доработки 28.09.09
Даны общие представления об апоптозе, особое внимание уделено исследованиям апоптоза у дрожжей. Подробно описаны условия индукции неспецифической проницаемости митохондрий животных и дрожжей, в частности исследованных нами дрожжей аэробного типа Yarrowia Нро1уНеа и Dipodascus (ЕМотуеез) magnusii, которые имеют полностью компетентную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения и хорошо структурированные митохондрии и для которых проверены практически все условия, вызывающие индукцию пор(ы) в митохондриях животных. Сделан вывод, что митохондрии дрожжей лишены Са2+-зависимых пор, а именно классической Са2+/Ргзависимой циклоспорин А-чувствитель-ной поры, даже при деэнергизации митохондрий или истощении пула адениновых нуклеотидов, а также поры, индуцируемой в митохондриях животных одновременным добавлением Са2+ (в присутствии Са2+-ионо-фора ЕТН129) и насыщенных жирных кислот. Не образуется пора и при инкубации дрожжевых митохондрий в присутствии высоких концентраций неорганического фосфата при кислых значениях рН. Сделан общий вывод, что образование поры в дрожжевых митохондриях не связано с поглощением Са2+ и регулируется иначе, чем в митохондриях животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии, дрожжи Yarrowia ИроУ^, Dipodascus (ЕМотуеез) magnusii, Са2+, неорганический фосфат, жирные кислоты, рН, мембранный потенциал, набухание, пора, апоптоз.
Исследования, проведенные в последнее десятилетие, позволили осознать, что по крайней мере в клетках животных митохондрии, выполняющие важную функцию в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют еще и решающую роль в индукции апоптоза (или некроза). Апоптоз понимается сейчас как четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток для контролируемого удаления невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток [1]. Согласно рекомендации Номенклатурной комиссии по клеточной смерти этот вид
Принятые сокращения: ЦсА — циклоспорин А, ETH129 — специфический Са2+-ионофор N,N,N'N'-TeT-ра(циклогексил)диамид дигликолевой кислоты, mPTP (mitochondrial permeability transition pore) — неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны, Рн — неорганический фосфат, YMUC (yeast mitochondrial unspecific channel) — дрожжевой митохондриаль-ный неспецифический канал. * Адресат для корреспонденции.
клеточной смерти отличается от других (некроза, аутофагии, митотической катастрофы и других видов) характерным набором морфологических и биохимических признаков: переходом фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный, иногда выходом цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, активацией цистеиновых протеаз (каспаз), образованием активных форм кислорода, сморщиванием (ЫеЪЫ^) цитоплазматической мембраны, уменьшением объема клетки, разрывом нитей ядерной ДНК в межнуклеосомных участках, конденсацией хроматина по периферии ядра с последующим распадом ядра на части, фрагментацией клеток с образованием апоптотичес-ких телец. Изучение апоптоза находится в настоящее время в центре внимания исследователей (начиная с 2000 г. число публикаций растет в геометрической прогрессии и уже сейчас составляет ~2% всех публикаций по биологии). Такой интерес предопределен тем, что апоптоз — важнейший обязательный механизм онтогенеза,
морфогенеза, антираковой защиты организма — в ряде случаев может усиливать тяжелые поражения организма, вызывая массовую гибель клеток (например, при септическом шоке, инфаркте миокарда, инсульте, нейродегенератив-ных заболеваниях).
До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойствен лишь высшим многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптоти-ческие факторы многоклеточных, и поскольку существовал скепсис относительно физиологической целесообразности и эволюционных преимуществ апоптоза у одноклеточных организмов, в том числе и у дрожжей. Первое указание на возможность клеточной смерти дрожжей по механизму, напоминающему апоптоз, было получено в экспериментах, в которых животные про- или антиапоптотические белки были гете-рологически экспрессированы в дрожжах Saccharomyces cerevisiae [2, 3]. В этих опытах дрожжевые клетки либо умирали, демонстрируя набор физиологических маркеров апоптоза, либо избегали смерти в зависимости от присутствия про- или антиапоптотических белков. В 1997 г. был описан температурозависимый мутант дрожжей S. cerevisiae, несущий точечную мутацию в гене CDC48. Этот мутант при непереносимых температурах умирал по механизму апоптоза (с перераспределением фосфатидилсе-рина в цитоплазматической мембране, конденсацией хроматина, фрагментацией клеток) [4]. А в 2002 г. в дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован и первый проапоптотический белок, участвующий в апоптозе дрожжей, — метакаспа-за (цистеиновая протеаза), названная дрожжевой метакаспазой-1 (Ycalp) [5], функциональный аналог митохондриальных каспаз животных.
С тех пор были получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток (в основном исследования проводились на дрожжах S. cerevisiae) по механизму апоптоза, обусловленного разными внешними стимулами и внутриклеточными дефектами [6—15], а также реп-ликативным или хронологическим старением [16—18] с участием не только метакаспазы, но и ШгА2-подобного белка [19], AIF и AMID (AIF-homologous mitochondrion-associated inducer of death) [20], белка Dnm1p [21], гомолога белка Drp1p животных, ответственного за дробление митохондрий человека, цитохрома с [22, 23], эн-донуклеазы G [24, 25], Rho5 GTPазы (при апоп-тозе, запускаемом активными формами кислорода) [26] и пока единственного антиапоптоти-ческого фактора Bir1p [27]. По нашим данным,
дрожжи У. Иро1уИса, геном которых хорошо изучен [28], содержат те же апоптотические факторы, что и дрожжи сегеу1э1ае (таблица).
Совокупность этих данных можно рассматривать как веское указание на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы. Интенсивные исследования последних лет позволили пролить свет и на физиологическую значимость и целесообразность апоптоза для дрожжей. Сейчас уже ясно, что природные микроорганизмы, в том числе и дрожжи, предпочитают жить в многоклеточных сообществах (биопленки, колонии) [29—31]. Описаны и механизмы (образование ароматических спиртов), способствующие социальному взаимодействию между клетками дрожжей. Колонии дрожжей могут рассматриваться как многоклеточные ассоциации, которые подвергаются подобию дифференциации, связанной с апоптозом. Для клеток дрожжей очевидны преимущества апоптоза, запускаемого феромоном или старением. Удаление инфертильных (не способных спариваться) или поврежденных клеток может давать преимущество диплоидным клеткам, лучше адаптированным к окружающим условиям, чем гаплоидные клетки. Удаление старых и поврежденных клеток при старении или голодании увеличивает шансы оставшихся клеток выжить и спорулировать, тем самым повышая вероятность выживания клонов. Более того, увеличенная продукция активных форм кислорода в этих условиях повышает вероятность появления генетических вариантов, которые могут адаптироваться к меняющимся условиям. Следовательно, альтруистическая смерть, обусловленная активацией высококонсервативной самодеструктивной энзиматичес-кой машины, дает преимущества популяции, увеличивая ее генетическое разнообразие в результате как сексуальной репродукции, так и соматических мутаций. В то же время апоптоз, ограничивая длительность жизни, способствует генетическому консерватизму.
Таким образом, в области изучения апоптоза дрожжей за последние несколько лет достигнут впечатляющий прогресс. Пришло осознание того, что дрожжи, характеризующиеся относительной простотой строения, растущие с высокой скоростью на средах простого состава, имеющие относительно малые размеры хорошо изученного генома, отличающиеся легкостью изменения физиологического и генетического статуса, являются чрезвычайно удобной моделью не только для функционального анализа уже известных про- и антиапоптотических факторов, но и для выявления новых (см., например, [8, 25, 32]).
Компоненты, которые могут участвовать в образовании неспецифической поры в митохондриях У. lipolytica, и апоптоти-ческие факторы, найденные в этих дрожжах
Белок Гены Степень гомологии
Цитохром c 70—80% сходства с двумя изоформами цитохрома c S. cerevisiae
Митохондриальный порин рамка считывания УАЫ0Р1731^ 42% сходства с митохондриальным порином S. cerevisiae
Циклофилин D СРЯ6 46, 48 и 56% сходства с циклофилином D S. cerevisiae, человека и лошади соответственно
Транслоказа адениновых нуклеотидов (ANT1, ANT2, ANT3) УШ^, AAC2, AAC3 70—80% сходства с тремя формами ANT S. cerevisiae
Метакаспаза 1 рамка считывания УАЫ0Р04059к 60% сходства с метакаспазой S. cerevisiae
Эндонуклеаза G рамка считывания YALI0D05071g 66% сходства с visiae эндонуклеазой G S. cere-
HtrA-протеаза (Nma111p в S. cerevisiae) рамка считывания YALI0F31603g 49% сходства с Nma111p S. cerevisiae
Rad9p рамка считывания YALI0E31273g 30% сходства с Rad9p S. cerevisiae
Alg2p ALG2 42% сходства с Alg2p S. cerevisiae
Ysp1p рамка считывания YALI0A09020g 30% сходства с Yspl S. cerevisiae
Примечание. Для идентификации апоптотических факторов У. lipolytica использовали систему поиска SRS (ЦшРго^ (для получения общей информации о белке и его локализации на хромосоме) и программу В1а81Р (для выявления гомологии в структуре белков).
Особая роль митохондрий в системе выбора клетки между жизнью и смертью определя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.