ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 545-550
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 632.938:633.11:6324:547.587.11
ИНДУКЦИЯ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К Septoria nodorum Berk.
© 2007 г. Н. Б. Трошина, Л. Г. Яруллина, Ä. Ш. Валеев, И. В. Максимов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАИ, 450054 Уфа, просп. Октября, 69.
E-mail: phyto@anrb.ru Поступила в редакцию 29.11.2005 г.
Исследовали влияние салициловой кислоты (CK) на активность оксалатоксидазы и пероксидазы, а также генерацию перекиси водорода (H2O2) в клетках листьев мягкой пшеницы восприимчивого сорта Жница при инфицировании возбудителем септориоза S. nodorum. Обнаружено, что гифы гриба распространялись по межклетникам мезофилла. В инфицированных тканях выявлялось наличие H2O2. Обработка CK приводила к усилению генерации H2O2 в клетках мезофилла, что было обусловлено активацией оксалатоксидазы и пероксидазы в области клеточной стенки. Высказывается предположение, что индукция защитного ответа в растениях пшеницы при грибной инфекции осуществляется за счет модулирующего эффекта CK на активность оксидоредуктаз.
Генерация активных форм кислорода (АФК) при патогенезе связана с активностью внеклеточных ферментов, локализованных в плазмалемме и клеточной стенке, например, НАДФН-оксида-зы, оксалатоксидазы и пероксидазы (Dumas et al., 1995; Thordal-Christensen et al., 1997; Хайруллин и др., 2001). Значительное повышение содержания АФК вне клетки оказывает прямое антифунгаль-ное действие на развитие патогенных микроорганизмов и способствует (через активацию антиок-сидантной системы) лигнификации клеточной стенки (Николаев, Аверьянов, 1991).
Образующаяся в результате окислительного взрыва перекись водорода проникает в клетки растений, где в невысокой концентрации способствует предадаптации растений к последующему действию стрессора (Gechev et al., 2002). Например, АФК выступают в качестве сигнальных молекул в запуске каскада защитных реакций в растениях (Huckelhoven, Kogel, 2003). Однако резкое стресс-индуцированное возрастание концентрации молекул АФК может негативно отразиться на жизнеспособности растительных клеток (Ma-zel, Levine, 2001), что требует контроля ее уровня. Таким образом, совокупность про- и антиокси-дантных ферментов растений образует сложную полиферментную систему, ответственную за баланс АФК вне- и внутри клетки (Скулачев, 1998; Турпаев, 2002).
Одним из механизмов усиления генерации Н2О2 в растениях при грибном патогенезе является специфическое ингибирование СК активности каталазы и пероксидазы (Chen et al., 1993; Durner, Klessig, 1996). Показано, что культивирование инфицированных возбудителем твердой головни каллусов пшеницы на среде, содержащей СК,
приводит к генерации Н2О2 в паренхимоподоб-ных клетках (Трошина и др., 2004). Поскольку формирование защитного ответа в растениях определяется типом взаимоотношений патогена с растением-хозяином (Морозов, 1992), значительный интерес представляют данные о влиянии СК на генерацию H2O2 в клетках листьев растений пшеницы, инфицированных возбудителем септориоза, с одновременной оценкой в них активности оксалатоксидазы и пероксидазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на проростках мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Жница, восприимчивого к возбудителю септориоза Septoria nodorum Berk. Часть семян перед проращиванием замачивали 3 ч в 0.05 мМ СК (Шакирова, 2001). Семена проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые первые листья 7-суточных проростков срезали и помещали в чашки Петри на влажную вату с добавлением бензимидазола (40 мг/л). Часть листьев инокулировали суспензией пикноспор гриба (106 спор/мл) по методике, приведенной в работе (Пыжикова, Карасева, 1985). Через 2-4 сут после инокуляции в листьях оценивали число клеток, генерирующих H2O2, по окислению хро-могенного субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) с индукцией реакции щавелевой кислотой по методикам, изложенным в работах (Caliskan, Cuming, 1998; Ganesan, Thomas, 2001). Появление бурого окрашивания свидетельствовало об отложении ДАБ-материала в местах генерации H2O2. Для контроля специфичности окрашивания листья были инкубированы в ДАБ без добавления щавелевой кислоты или предобработаны в 4 мМ
1
Размер септориозного пятна, мм 20 -
15
10
Рис. 1. Влияние салициловой кислоты (СК) на интенсивность генерации Н2О2 в листьях пшеницы при инфицировании 51. nodorum на 2-е сут после инокуляции: 1 - контроль, 2 - 5. nodorum, 3 - СК, 4 - СК + 5. nodo-гит. Стрелками указаны зоны инфицирования с клетками, генерирующими перекись водорода.
растворе Fe(NO3)3 30 мин для инактивации окса-латоксидазы (Berna, Bernier, 1999). В обоих вариантах появления ДАБ-материала в клетках листьев не обнаруживалось. После окрашивания отрезки листьев фиксировали в смеси спирта и уксусной кислоты (3 : 1). Парафиновые срезы окрашивали 1%-ным метиленовым синим. В этот же период в листьях анализировали активность оксалатоксидазы и пероксидазы.
Для выделения цитоплазматической (растворимой) фракции оксалатоксидазы и пероксидазы отрезки листьев гомогенизировали в 0.01 М фосфатном буфере с pH 6.2 (ФБ). Отношение массы навески к объему ФБ составляло 1 : 3. Экстракт центрифугировали 25 мин при 14000 об/мин на центрифуге 5415К (Eppendorf, Германия). Су-пернатант использовали для анализа активности растворимых форм ферментов. Осадок многократно промывали ФБ для освобождения от ци-топлазматических белков, ионносвязанную с клеточными стенками фракцию ферментов экстрагировали 1 М NaCl (Ranieri et al., 1996). При определении активности оксалатоксидазы реакционная смесь содержала 50 мкл растительного экстракта, 100 мкл 0.05 М сукцинатного буфера (рН 3.8), 0.0025 М щавелевую кислоту и 0.15%-ный хромогенный субстрат орто-фенилендиа-мин (ОФД) (Vuletic, Sukalovich, 2000). Для определения активности пероксидазы использовали 0.15%-ный ОФД и 0.0015%-ный раствор перекиси
4 6 8 10 12 Время после инфицирования, сут
Рис. 2. Изменение интенсивности развития септори-оза на листьях пшеницы под влиянием салициловой кислоты: 1 - 5. nodorum, 2 - СК + 5. nodorum.
водорода в 0.01 М ФБ. Оптическую плотность окисленного ОФД определяли спектрофотомет-рически при 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-340/620-01 (С.-Петербург, Россия).
Для сравнительного анализа активности выражали в относительных единицах на 1 г сырой массы. Единица активности ферментов соответствовала количеству окисленного субстрата, вызывающему увеличение оптической плотности АА на единицу за 1 мин.
В качестве контроля использовали отрезки не-инфицированных и необработанных СК листьев. Опыты проводили в 3 повторностях, в каждом варианте фиксировали по 8-10 листьев. В таблицах показаны средние значения и их стандартная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На отрезках листьев генерация H2O2 выявлялась только при инфицировании в зоне нанесения инокулюма возбудителя септориоза, под влиянием СК генерация H2O2 усиливалась (рис. 1). Симптомы септориоза регистрировали уже через 4 сут после инокуляции листьев, по мере развития болезни они усиливались (рис. 2).
В контроле (рис. 3 а) и в предобработанных СК листьях здоровых растений генерация H2O2 выявлялась в межклеточных пространствах сосудистых пучков, что согласуется с литературными данными (Талиева, Мишина, 1996; Ros Barcelo, 1998). Гифы S. nodorum распространялись по меж-
2
2
3
5
4
0
клетникам мезофилла, как отмечалось и другими исследователями (Bird, Ride, 1981; Palmer, Skinner, 2002), и не встречались в клетках эпидермиса и обкладки сосудистого пучка. Подобное распространение инфекционного мицелия характерно и для других гемибиотрофных грибов (Морозов, 1992). Вероятно, устойчивость клеток обкладки сосудистого пучка обусловлена ранним и обильным отложением в клеточных стенках лигнина (Huckelhoven, Kogel, 2001).
В клетках и межклетниках мезофилла генерация H2O2 выявлялась только в зонах роста фито-патогена (рис. 3б-д), что согласуется с результатами визуальных наблюдений (рис. 1) и данными других исследователей (Medeghini et al., 1994; Bestwick et al., 1997; Thordal-Christensen et al., 1997). Через 2 сут после инокуляции она выявлялась в столбчатом мезофилле, через 3 и 4 сут по мере продвижения патогена по межклетникам листа - в столбчатом и губчатом мезофилле (рис. 36, в). При этом доля генерирующих H2O2 клеток губчатого мезофилла была значительно выше, чем столбчатого (табл. 1). Ранее нами в аналогичном опыте показано большее увеличение площади клеток губчатого мезофилла по сравнению со столбчатым (Трошина и др., 1993). Такие же результаты были получены на листьях растений арахиса, инфицированных гемибиотрофным грибом Cercospora arachidicola (Vijayakumar, 1990). Увеличение размеров клеток может быть свидетельством повышения их метаболической активности.
Предобработка растений пшеницы CK приводила к возрастанию доли клеток мезофилла, в которых выявлялась генерация H2O2 (рис. 1, табл. 1), что, вероятно, и способствовало снижению интенсивности развития возбудителя септо-риоза (рис. 2). Так как в опыте CK использовали для замачивания семян, а генерацию перекиси водорода оценивали в листьях спустя несколько суток после инфицирования грибом S. nodorum, то такое пролонгированное воздействие препарата предполагает активацию целого ряда метаболических изменений, приводящих к снижению интенсивности развития болезни.
Интересно, что в листьях предобработанных CK растений различия между столбчатой и губчатой паренхимой по доле клеток, генерирующих H2O2, сохранялись (табл. 1). Причины предпочтительного заселения губчатой ткани листа возбудителем септориоза могут быть связаны с особенностями питания патогена, так как известно, что в столбчатой ткани усилено накопление белка и крахмала, а в губчатой - сахаров (Мокроносов и др., 1973).
Результаты биохимического анализа показали, что в листьях растений пшеницы через 48 ч после инфицирования в период распознавания па-
(б)
■■
(г)
.J/
(д)
Рис. 3. Выявление генерации Н2О2 (указано стрелками) в клетках здоровых (а), инфицированных возбудителем септор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.