МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 850-858
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ^^^^^^^^ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.113.7
ИНДУЦИРОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОЙ АССОЦИАЦИИ ДНК АМФИФИЛЬНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ 1,3-ДИАЗААДАМАНТАНА С ГИДРОФОБНЫМИ БОКОВЫМИ ЦЕПЯМИ
© 2014 г. О. К. Мамаева1, А. Г. Габриелян2, Г. Л. Арутюнян2, Т. Н. Бочарова3, Е. А. Смирнова3, А. А. Володин3, А. К. Щелкина1, Д. Н. Калюжный1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 Россия 2Институт тонкой органической химии им. А.Л. Мнджояна Национальной академии наук Республики Армения,
Ереван, 0014 Армения
3Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 Россия
Поступила в редакцию 25.04.2014 г.
Принята к печати 28.04.2014 г.
Известно, что некоторые лиганды поликатионной природы эффективно ускоряют реакцию обмена гомологичных нитей ДНК. Еще один класс соединений, эффективно ускоряющих эту реакцию в системе коротких олигонуклеотидов, — амфифильные производные 1,3-диазаадамантанов. Показано, что ускорению реакции обмена нитей способствовала большая длина гидрофобных боковых групп 1,3-диазаада-мантанов. В данной работе оптическими методами исследовано взаимодействие с ДНК двух производных 1,3-диазаадамантанов с разной длиной боковых цепей. По увеличению интенсивности флуоресценции зонда 1-анилино-8-нафтален сульфоната определены области концентраций, в которых исследуемые 1,3-диазаадамантаны образуют мицеллы, а также определена область концентраций, при которых соединения существуют в виде истинных растворов. Афинность 1,3-диазаадамантанов к ДНК изучена методом вытеснения флуоресцирующего интеркалятора тиазолового оранжевого. Значительное увеличение гидродинамического объема короткой шпильки ДНК в комплексе с 1,3-диазаадамантанами наблюдали по возрастанию поляризации флуоресценции зонда бромистого этидия, связанного с ДНК. Межмолекулярную ассоциацию олигонуклеотидов ДНК при связывании с 1,3-диазаадамантанами подтвердили по безызлуча-тельному переносу энергии в системе эквимолярной смеси флуоресцентномеченых шпилек. Показано, что количество положительных зарядов на производных 1,3-диазаадамантанов влияет на их афинность к ДНК, тогда как большая длина боковых цепей обеспечивает эффективное межмолекулярное взаимодействие ДНК.
Ключевые слова: межмолекулярное взаимодействие ДНК, олигонуклеотиды, 1,3-диазаадамантаны, флуоресценция, компьютерное моделирование.
STIMULATION OF DNA MOLECULES ASSOCIATION WITH AMPHIPHILIC DERIVATIVES OF 1,3-DIAZAADAMANTANE CONTAINING HYDROPHOBIC SIDE CHANINS, by O. K. Mamaeva1, A. G. Gabrielian2, G. L. Harutjunyan2, T. N. Bocharova3, E. A. Smirnova3, A. A. Volodin3 À. K. Shchyolkina1, D. N. Kaluzhny1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 119991 Russia; *e-mail: uzhny@mail.ru; 2Mndzhoyan Institute of Fine Organic Chemistry, RTCOPC, Armenian National Academy of Sciences, 0014 Armenia; 3 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, 123182 Russia). Earlier, a new class of compounds — amphiphilic derivatives of 1,3-diazaadamantanes, capable of facilitating the strand exchange in the system of short oligonucleotides was revealed. Longer hydrophobic side chains of 1,3-diazaadamantanes promoted stronger acceleration of the reaction. In this study, interaction with DNA of two 1,3-diazaadamantane derivatives containing different side chains was investigated by use of optical methods. Concentration of the investigated 1,3-diazaadamantans micelles formation were determined by the means of monitoring fluorescence intensity enhancement of 1-anilinonaphtalene-8-sulphonate probe; as well as the ranges of concentrations where the compounds/water mixtures existed as true solutions. 1,3-diazaadaman-tanes affinity to DNA was determined with Fluorescent Intercalator Displacement (FID) approach. Significant increase in hydrodynamic volume of short DNA hairpins in the complexes with 1,3-diazaadamantanes was revealed by estimation of the fluorescence polarization of ethidium bromide probe bound to the hairpins. Intermo-
Принятые сокращения: ТО — тиазоловый оранжевый; FRET — Förster resonance energy transfer in system (Фёрстеровский резонансный перенос энергии); EtBr — бромистый этидий; ANS — 1,8-ANS (1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) 1-анилино-нафтален-8-сульфоновая кислота.
* Эл. почта: uzhny@mail.ru
lecular association of DNA hairpins upon binding with 1,3-diazaadamantans was confirmed by Förster resonance energy transfer in system of an equimolar mixture of fluorescently labeled with Cy-3 and Cy-5 hairpins. In this study, the number of positive charges at 1,3-diazaadamantane derivatives containing side chains of different lengths was demonstrated to affect their affinity to DNA, whereas longer length of the hydrophobic side chains ensured more efficient interaction between the DNA duplexes that may facilitate, in particular, DNA strand exchange.
Keywords: intermolecular DNA interactions, oligonucleotides, 1,3-diazaadamantanes, fluorescence, computer modeling
DOI: 10.7868/S0026898414050103
ВВЕДЕНИЕ
Химически инертные соединения адамантана известны широким спектром применимости в медицине и в прикладных научных целях благодаря большим размерам и конформационной жесткости адамантанового каркаса. Производные 1,3-ди-азаадамантана отличаются от химически инертных производных адамантана наличием двух третичных атомов азота в каркасе, что позволяет, в частности, получать их в водорастворимом виде гидрохлорида. Эти два атома азота обеспечивают химическую активность 1,3-диазаадамантанов.
В отличие от реакций обмена нитей ДНК, которые происходят при участии белков гомологичной рекомбинации из разных организмов, такие реакции, происходящие спонтанно или инициированные различными агентами в безбелковых системах (см., например, [1]), изучены довольно слабо, хотя они представляют большой интерес как для понимания механизмов гомологической рекомбинации, так и для технологического применения. В случае некоторых поликатионов, в частности катионного гребенчатого сополимера (ССС), обнаружена способность ускорять обмен гомологичных нитей коротких олигонуклеотидов [2]. Взаимодействие ДНК с гистоном Н1 также стимулировало обмен нитей [3]. Обнаружен обмен нитей для олигонуклеотидов, адсорбированных на катионных липосомах [4] и в концентрированных растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ) [5].
Катионные 1,3-диазаадамантаны с гидрофобными боковыми цепями — еще один класс соединений, имеющих свойство эффективно ускорять обмен нитей. Ранее исследовано влияние отдельных элементов структуры 1,3-диазаадамантанов на их активность в реакции обмена гомологичных нитей ДНК [6] и показано, что существенное влияние на эту активность оказывает длина боковых алифатических цепочек в составе этих соединений.
Цель настоящей работы — изучение образования комплексов ДНК с 1,3-диазаадамантанами и, в первую очередь, роли зарядов и гидрофобных групп 1,3-диазаадамантанов в межмолекулярных взаимодействиях коротких дуплексов/шпилек ДНК. Нами показано, что увеличение числа положительных зарядов при протонировании 1,3-ди-
азаадамантанов увеличивает их сродство к ДНК, но не приводит к усилению межмолекулярных взаимодействий. Взаимодействие между молекулами олигонуклеотидов обеспечивают неионные силы между экспонированными в бороздке ДНК гидрофобными группами 1,3-диазаадамантанов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. Использовали 1,3-диазаадаман-таны HG-188 и HG-122 с разной длиной гидрофобных боковых групп (см. рис. 1). Соединения синтезированы в ИТОХ им. А.Л. Мнджояна НТЦОФХ НАН РА (г. Ереван) [7, 8].
Проверка идентичности и чистоты соединений. ИК-спектры сняты в вазелиновом масле на спектрофотометре "Nicolet AVATAR 330 FT-IR", спектры ЯМР1Н — на приборе "Varian Mercury-300" (300 МГц) в ДМСО-d6, внутренний стандарт — ТМС. Молекулярные массы определяли масс-спек-трометрически на приборе "МХ-1321А" с прямым вводом образца в источник ионов, ионизационное напряжение 70 эВ. Ход реакции и чистоту веществ контролировали с помощью ТСХ на пластинках "Silufol UV-254" в системе пропанол—вода (7 : 3), проявитель — нингидрин. Чтобы обеспечить водорастворимость, соединения HG-122 и HG-188 представлены в виде дигидрохлоридов.
В экспериментах использовали ДНК тимуса теленка ("SIGMA-ALDRICH"), концентрация ДНК в пробе равна 0.25 мкМ п.н., олигонуклеотиды d(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG) (ds26), Cy3-d(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG) (Cy3ds26) и
Cy5-d(CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG) (Cy5ds26) ("ДНК Синтез").
Олигонуклеотид ds26 способен образовывать как внутримолекулярную шпильку, так и самокомплементарный дуплекс. Для образования преимущественно внутримолекулярных шпилек образец ds26 в буфере нагревали до температуры 90°С и быстро охлаждали во льду. Все измерения проведены при комнатной температуре в растворе, содержащем 100 мМ KCl и 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.8 или рН 6.5. В экспериментах по определению сродства 1,3-диазаадамантанов к
Шифр Схема Название
HG-188 tío Дигидрохлорид 1'-бензил-5,7-дибутил-6-оксоспиро (1,3-диазаадамантан-2,4'-пиперидина)
HG-122 tío Дигидрохлорид 1'-бензил-5,7-дипропил-6-оксоспиро (1,3-диазаадамантан-2,4'-пиперидина)
Рис. 1. Структуры исследуемых 1,3-диазаадамантанов.
ДНК использовали тиазоловый оранжевый (ТО) ("SIGMA-ALDRICH"), концентрация в пробе 1 мкМ. В пробы добавляли аликвоты HG-122 или HG-188 из исходных растворов с концентрацией 0.25 M. Работа выполнена на спектрофлуоримет-ре Photon Technology International, спектрофлуо-риметре Cary Eclipse (Varian) и спектрофотометре JascoV-550.
Методы. Спектральные характеристики 1,3-ди-азаадамантанов не позволяют регистрировать их связывание с ДНК, так как полосы поглощения в УФ области 1,3-диазаадамантанов и ДНК перекрываются. В качестве удобного спектрального метода для регистрации взаимодействия 1,3-ди-азаадамантанов с ДНК выбран флуоресцентный метод вытеснения красителя ТО из его комплекса с ДНК при помощи лигандов — 1,3-диазаадаман-танов (FID) [9]. Константу диссоциации комплексов ТО с ДНК (K
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.