ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА,, 2014, том 33, № 5, с. 69-75
ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 535.372.3; 538.958
ИНДУЦИРОВАННАЯ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПО ДАННЫМ ТРИПТОФАНОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛКА © 2014 г. И. М. Власова*, В. В. Журавлева, А. М. Салецкий
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова *Е-таП: vlasovairina1979@mail.ru Поступила в редакцию 24.04.2013
По анализу триптофановой флуоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА) исследованы денатурационные переходы БСА под действием додецилсульфата натрия (ДСН) при различных значениях рН. Поэтапное тушение триптофановой флуоресценции БСА и поэтапное увеличение степени анизотропии триптофановой флуоресценции БСА при увеличении концентрации ДСН в растворах указывают на стадийный характер денатурации: первая стадия — разрыхление белковых глобул, вторая стадия — полное разворачивание аминокислотной цепи белка. При рН < р1 БСА денатурация проходит через обе стадии. При рН > р1 БСА денатурация проходит слабо и останавливается на первой стадии. Более эффективная денатурация БСА под действием ДСН происходит при рН < р1 БСА, а по мере возрастания рН эффективность денатурации БСА под действием ДСН уменьшается.
Ключевые слова: триптофановая флуоресценция, бычий сывороточный альбумин, додецилсульфат натрия, ионные детергенты, денатурация белка.
Б01: 10.7868/$0207401Х1405015Х
ВВЕДЕНИЕ
В данной работе исследуется денатурация бычьего сывороточного альбумина (БСА) под действием анионного детергента додецилсульфата натрия (ДСН) по анализу собственной триптофановой флуоресценции БСА. Бычий сывороточный альбумин — глобулярный белок семейства альбуминов (изоэлектрическая точка БСА (р1) — 4.9, молекулярная масса БСА — 64 кДа [1]. Он представляет собой транспортный белок плазмы крови. Способность молекул БСА связывать обширный круг органических и неорганических лигандов определяет одну из основных функций этого белка — транспорт физиологических метаболитов. Кроме того, благодаря доступности исходного материала и стабильным методикам его выделения БСА широко применяется в биохимической и медицинской лабораторной практике. Он применяется также в качестве стандарта в различных методах количественного определения белков.
Первичная структура БСА определяется единственной полипептидной цепью, состоящей из 582 аминокислотных остатков. Вторичную структуру БСА на 50—68% составляют а-спи-рали, 16—18% — Р-складки. Третичная структура БСА определяется тремя доменами, расположен-
ными под углом друг к другу. Стабильность третичной структуры зависит не только от системы нековалентных взаимодействий внутри белковой глобулы, но и дополнительно стабилизируется ковалентными дисульфидными связями.
Бычий сывороточный альбумин — типичный представитель белков семейства альбуминов, имеющий схожее строение (с небольшими различиями) с сывороточным альбумином человека (САЧ). В частности, в отличие от САЧ, имеющего один остаток триптофана (Тгр 214), БСА имеет в своей аминокислотной цепи два остатка триптофана — Тгр 135 и Тгр 214.
В исследовании белков широко применяются детергенты — как ионные, так и нейтральные [2—4]. Многие ионные детергенты являются эффективными денатурирующими агентами, например анионный детергент ДСН, широко использующийся в биохимической и медицинской практике при электрофорезе белков в полиакриламидном геле для определения их массы.
Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структур белка, т.е. нарушение, разупорядочивание системы некова-лентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация сопровож-
дается утратой белком функциональных свойств, что обуславливает интерес к изучению ее механизмов.
Цель данной работы — исследование денатурации БСА под действием ДСН при различных значениях pH по анализу собственной триптофано-вой флуоресценции БСА. Исследование трипто-фановой собственной флуоресценции белков широко применяется для оценки структурного состояния белковых молекул и анализа их взаимодействия с различными лигандами [5—17], так как флуоресцентные свойства триптофановых остатков в молекулах белков весьма чувствительны к перестройкам белковых глобул при взаимодействии их с лигандами. По изменению спектральных характеристик флуоресценции триптофанов (по интенсивности и положению максимума спектра флуоресценции) и по изменению поляризации флуоресценции триптофанов Trp 135 и Trp 214 БСА можно судить о конформационном состоянии глобул БСА в растворах с денатурирующим агентом ДСН.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растворы БСА (5 мкМ) производства фирмы "Sigma" приготовлены в двух буферных системах: 0.1 М CH3COOH - KOH (pH 3.5-5.0) и 0.1 М KH2PO4 - 0.1 М NaOH (pH 5.5-8.0). В растворы БСА с разными значениями pH добавлены различные концентрации 0.5-7.0 мМ ДСН ("Sigma").
Флуоресцентные исследования проводили на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS55 при комнатной температуре. Триптофановая флуоресценция БСА регистрировалась в диапазоне 300-500 нм при возбуждении светом с длиной волны ^возб = = 295 нм. Измерения флуоресценции образцов БСА проводили через фиксированный интервал времени после добавления в них ДСН.
Степень анизотропии r триптофановой флуоресценции БСА рассчитывали по значениям 7 и 7± в максимуме спектра испускания флуоресценции БСА, где 7|| и 7± - интенсивности свечений, поляризованных по двум взаимно перпендикулярным направлениям. Спектры флуоресценции обрабатывались программой Perkin Elmer FL Winlab.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведены исследования неполяризованной триптофановой флуоресценции БСА в растворах с различными концентрациями ДСН при различных значениях рН. Получены зависимости интенсивности в максимуме спектров триптофано-
вой флуоресценции БСА (/ф^) от концентрации
ДСН для различных значений рН (рис. 1). Характер изменений спектров триптофановой флуоресценции БСА при увеличении концентраций ДСН в растворах разный для значений рН 3.5—4.5, меньших изоэлектрической точки БСА (р1 4.9), и для значений рН 5.0—8.0, больших р1 БСА.
В растворах с ДСН триптофановая флуоресценция БСА тушится (рис. 1). Тушение триптофановой флуоресценции БСА в присутствии ДСН объясняется денатурацией белка, вследствие которой при разворачивании глобулы хромофорные группы триптофановых остатков становятся более доступными для молекул воды, тушащих их флуоресцентное свечение.
На рис. 2 представлено отношение среднего изменения интенсивности в максимуме спектра флуоресценции БСА к изменению концентрации ДСН при различных значениях рН. Видно, что более сильное тушение триптофановой флуоресценции БСА при одинаковых концентрациях ДСН наблюдается при более низких значениях рН. Обнаружена следующая закономерность тушения флуоресценции БСА в растворах с ДСН от рН: чем выше рН раствора, тем слабее тушение флуоресценции БСА. Молекулы ДСН в растворе распадаются на положительно заряженные ионы натрия и додецилсульфат-анионы, и именно доде-цилсульфат-анионы взаимодействуют с БСА (в работе исследованы концентрации ДСН, меньшие его критической концентрации мицеллообразо-вания).
При рН < р1 БСА молекулы БСА в целом заряжены положительно. Поэтому в растворах с ДСН при низких значениях рН происходит интенсивное связывание в целом положительно заряженных макромолекул БСА с додецилсульфат-аниона-ми, вследствие чего наблюдается сильное тушение триптофановой флуоресценции БСА в растворах с ДСН по сравнению с растворами без ДСН.
По мере увеличения рН в целом положительный заряд макромолекулы БСА уменьшается, а при рН > р1 молекулы БСА приобретают в целом отрицательный заряд. Поэтому при высоких значениях рН (больших р1) происходит слабое связывание додецилсульфат-анионов и в целом отрицательно заряженных молекул БСА (хотя еще и сохраняющих некоторые положительно заряженные участки), вследствие чего в растворах с ДСН наблюдается слабое тушение триптофановой флуоресценции БСА. Следовательно, более сильная денатурация БСА под действием ДСН происходит при значениях рН, меньших р1.
Установленные экспериментальные зависимости /флакс от концентрации ДСН (рис. 1) можно объяснить стадийным механизмом денатурации БСА в присутствии ДСН. При этом характер за-
I мЛкс, отн. ед.
0 1 2 3 4 5 6 7
[ДСН], мМ
Рис. 1. Зависимость интенсивности /фЛКС в максимуме спектра триптофановой флуоресценции (^возб = 295 нм) БСА (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН: 3.5 (1), 4.0 (2), 4.5 (3), 5.0 (4), 5.5 (5), 6.0 (б), 6.5 (7), 7.0 (8), 7.5 (9), 8.0 (10).
» т-макс тт/^тт
висимостеи I фл от концентрации ДСН определяется тем, выше или ниже р1 БСА находится рН.
При значениях рН 3.5—4.5, меньших р1 БСА, денатурация БСА в присутствии ДСН представляет собоИ не непрерывный одностадийный процесс, а ступенчато-двустадийный. При концентрациях ДСН, меньших 1 мМ, наблюдается тушение триптофановой флуоресценции альбумина. Затем, в области концентраций ДСН от 1 до 2 мМ,
макс
значение I фл практически постоянно. При концентрациях ДСН до 2 мМ протекает первая переходная стадия денатурации белка: белковые глобулы БСА разрыхляются, но полного их разворачивания еще не происходит. При увеличении концентрации ДСН до 3 мМ наблюдается дальнейшее тушение триптофановой флуоресценции БСА, что указывает на переход белковых молекул из состояния разрыхленности во вторую стадию денатурации — стадию полного разворачивания. При увеличении концентрации ДСН от 3 до 7 мМ усиления тушения триптофановой флуоресцен-
макс
ции альбумина не наблюдается; 1фл меняется незначительно, что указывает на полную денатурацию молекул БСА. Двухэтапное тушение собственной флуоресценции БСА при возрастании концентрации ДСН при значениях рН, меньших
р1 белка, объясняется двустадийным механизмом денатурации БСА и последовательными конфор-мационными перестройками белковой глобулы, приводящими к оголению триптофанов и увели-
рН
д е
0 10 20
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
—I-1-1-1-1-1-1-1-1
Я -40
О [Д
< -50
<
-60
70
Рис. 2. Отношение среднего изменения интенсивности триптофановой флуоресценции (^возд = 295 нм) БСА (5 мкМ)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.