УДК 577.117.3
ИНДУЦИРОВАННАЯ ИЗМЕНЕНИЕМ pH КОНФОРМАЦИОННАЯ ИЗОМЕРИЗАЦИЯ ЛЕГГЕМОГЛОБИНА ИЗ Arachis hypogea
© 2014 П. Басак, Р. Паттаняк, С. Наг, М. Бхаттачария*
Университет Калькутты, Кольцевая дорога Баллиганг 35, Кольката-700019, Индия; E-mail: bmaitree@gmail.com
Поступила в редакцию 24.01.14 После доработки 05.06.14
Термодинамическая стабильность и электростатические взаимодействия в белках в их нативном состоянии зависят от pH. В данной работе мы сообщаем об индуцированном изменением pH конформационном переходе гемсодержащего белка леггемоглобина (Leghemoglobin — Lb), выделенного из узелков корня бобового растения Arachis hypogea. В отличие от других гемопротеинов — миоглобина (Mb), гемоглобина (Hb) и ци-тохрома с (Cyt C), немного неизвестно о структурных характеристиках и взаимодействиях Lb, хотя установлена его функциональная значимость, выражающаяся в связывании кислорода и поддержании среды для фиксации молекулярного азота (N2). Мы изучили индуцированное изменением pH разворачивание этого белка и идентифицировали набор его конформационных изомеров с использованием многочисленных, заслуживающих внимания данных по флуоресценции как функции титрования. Нами были охарактеризованы индуцированные изменением рН в кислую или щелочную сторону конформационные переходы между структурными состояниями в диапазоне значений pH 2—11. В зависимости от условий в растворе Lb может находиться в одной из трех фаз: pH 2, 3, 4; pH 5, 6, 7 и pH 8, 9, 10. При изучении вторичной структуры с помощью КД-спектроскопии максимальное содержание а-спирали было выявлено при pH 7, при котором структура Lb является наиболее жесткой, как показано в эксперименте с флуоресцентной анизотропией. Было продемонстрировано, что продолжительность жизни триптофана максимальна при pH 10 и минимальна при pH 6, что предполагает разворачивание Lb. Таким образом, изменение микроокружения глоби-новой цепи при переходе pH в конечном итоге приводит к конформационным изменениям в этом мономерном белке Lb.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: леггемоглобин, pH-титрование, конформация белка, разворачивание, среднее значение эллиптичности, продолжительность жизни возбужденного состояния, микроокружение.
Леггемоглобин (Leghemoglobin — Lb) является мономерным гемсодержащим белком, доступным в узелках корней (in vivo) бобовых в диапазоне значений pH 6,0—7,2. Lb по третичной структуре сходен с миоглобином [1], переносит кислород от клеточной мембраны узелков на корнях бобовых на симбиосомы, представляющие собой мембраносвязанные внутриклеточные органеллы, в которых располагаются бактероиды — внутриклеточные азотфиксирующие формы бактерии Rhizobium. Протопорфирин в этих гемопротеинах является структурой, обеспечивающей перенос двухвалентных катионов. Гемоглобин и миоглобин получили широкую известность как переносчики и запасатели кис-
Принятые сокращения: ЬЪ — леггемоглобин, МЬ — миоглобин, КД — круговой дихроизм, а.о. — аминокислотные основания, т — время жизни возбужденного состояния.
* Адресат для корреспонденции.
лорода у млекопитающих. Известны структура и функции обоих белков, но относительно мало известно о структуре ЬЪ в условиях ¡и vitro (рН 6,8). Были проведены исследования ЬЪ из люпина и соевых бобов [2—4], хотя ЬЪ из АгаеЫз hypogea (земляной орех) ранее не был изучен в плане его структуры и функций. Эти мономерные белки связывают и транспортируют молекулярный кислород, тем самым способствуя поддержанию низкой концентрации кислорода внутри узелков корней [5]. Структура ЬЪ а соевых бобов (143 а.о.) очень схожа со структурой ЬЪ II люпина (153 а.о.), при выравнивании их последовательностей обнаруживаются 82 идентичных остатка. Уникальные свойства ЬЪ возникают, в основном, вследствие того, что карман для гема значительно больше и гибче, чем у гемоглобина, гем сильно вздернут, и проксимальный остаток гистидина ориентирован более благоприятно для связывания лиганда. Гемы ЬЪ из соевых бобов и люпина
1539
сходны друг с другом не только по их расположению и ориентации, но также в плане степени непланарности [6]. Сродство леггемоглобинов к кислороду в 11—24 раза выше, чем у миоглобина спермы кита, в основном из-за более высоких скоростей ассоциации. Изучение окси- и дезок-си-ЬЪ показало, что единственной чертой, объясняющей высокую скорость реакции с кислородом, является подвижность проксимального и дистального остатков гистидина в дезокси-леггемоглобине [7]. В замечательной структурной работе по изучению рН-зависимой тепловой денатурации ЬЪ из соевых бобов было показано, что максимальная стабильность белка наблюдается в диапазоне рН 5,9—9,2. Более того, тепловая денатурация белка происходит при нагревании раствора белка выше 25°, в то время как холодовая денатурация происходит при охлаждении раствора белка ниже 25° [8].
Динамика и конформация белка всегда изменяются, если изменилась окружающая среда в растворе. Если белок помещается в среду, которая изменяет силы взаимодействия Ван-дер-Ваальса, водородные и ионные связи, совместно удерживающие молекулу белка в определенной конформации, то в результате может произойти разворачивание молекулы белка из-за разрушения этих связей, и изменение рН среды может служить в качестве инструмента для анализа поведения белка.
Порфирины — широко распространенный класс молекул естественного происхождения, участвующих в широком круге важнейших биологических процессов: от транспорта кислорода до фотосинтеза и от катализа до изменения пигментации [9]. В ЬЪ, как и в миоглобине, связывающий кислород гем погружен внутрь глобина, одиночной полипептидной цепи из ~140 а.о., удерживающей пары гемовых групп от слишком близкого сближения. Согласно работе Николя с соавт. [10] связывание белком гема в ЬЪ намного слабее, чем в МЪ. Участие порфиринов во многих биологических процессах и возможность проследить их уникальные свойства на молекулярном уровне делают порфирин-содержащие белки исключительно полезными с точки зрения их применения.
Белки суперсемейства глобинов выполняют множественные функции, такие как эффективный транспорт 02 и модулирование биоактивности оксида азота. В растениях ЬЪ захватывает 02 и облегчает его диффузию к ^-фиксирующим бактероидам в узелках. ЬЪ8 поддерживают концентрацию свободного 02 на уровне 20—40 нМ в цитозоле клеток-хозяев и позволяют обеспечить адекватное снабжение АТФ и избежать инактивации фермента нитрогеназы при фикса-
ции N В растениях биливердин-подобные пигменты осуществляют важные функции при фотосинтезе и фотоморфогенезе и также связаны с понижением ^-фиксирующей активности и содержания и функционирования ЬЪ в подверженных старению узелках. Старение узелков бобовых, как естественное, так и вызванное стрессом (изменением рН), — слабо изученный процесс с потенциальным сельскохозяйственным и экологическим эффектом, т.к. он ограничивает функциональную продолжительность жизни узелков и, тем самым, фиксацию N В естественных условиях могут происходить реакции нитрования, т.к. ЬЪ может находиться под воздействием N0 — в течение нескольких недель и даже месяцев, и рН понижается до 5,5 во время старения узелков. Поэтому представляет интерес определение конформационных переходов ЬЪ при различных значениях рН окружающей среды для понимания, как функционируют узелки бобовых [11].
В настоящей работе нами были изучены интересные и важные аспекты структуры ЬЪ из АгаеЫз hypogea с целью анализа того, как изменения конформации и компактности этого белка связаны с изменением рН. Для этого мы использовали стационарную флуоресценцию, исследование анизотропии, измерение времени жизни возбужденного состояния для выявления прямой корреляции конформации белка и одновременного изменения рН. КД-спектроско-пия в дальнем ультрафиолете была также использована для количественного подсчета изменений, происходящих во вторичной структуре ЬЪ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение ЫЪ из корневых узелков А. Ьуро%га.
Узелки А. hypogea гомогенизировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8) при 4°. Гомогенат смешивали с поливинилпирролидоном в соотношении 0,3 г на 1 г узелков для удаления полифенолов. Смесь центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин и подвергали фракционированию добавлением твердого сульфата аммония до насыщения 50—80% с фосфатным буфером (рН 6,8) при 4°. Осадок растворяли в небольшом объеме буфера и диализировали при перемешивании против 0,1 мМ ЭДТА (рН 6,8) в течение 16 ч. Диализат затем центрифугировали при 25 000 g в течение 15 мин и наносили на колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенной 100 мМ фосфатным буфером при рН 6,8. Элюцию проводили в градиенте №С1 в фосфатном буфере (рН 6,8) и измеряли поглощение при 403 нм. Фракции с оптической плотностью более 0,25 ОЕ объединя-
лись и подвергались концентрированию в камере для ультрафильтрации с мембраной UM 10 [12].
Приготовление буфера. Монофосфат натрия, дифосфат натрия, бикарбонат натрия, лимонная кислота, хлорид калия, Tris, мочевина («Sigma-АЫйеп», США) применялись без дополнительной очистки. Содержащие KCl-HCl (pH 2), гли-цин-HCl (pH 3), цитрат натрия (pH 4, 5, 6), моно-и дифосфат натрия (pH 7), Tris-HCl (pH 8), гли-цин-NaOH (pH 9, 10) и NaHCO3-NaOH (pH 11) буферные растворы были приготовлены на воде Milli-Q и соответствующих реактивах аналитической чистоты. Все буферы (pH 2—11) готовили накануне их использования, pH доводили по необходимости добавлением HCl или NaOH.
Стационарная флуоресценция Lb при различных значениях pH. Изучение разворачивания проводилось в диапазоне pH 3—10. Белок инкубировали в растворах с различным значением pH в течение 3 ч. Образец белка возбуждали при 295 нм, толщине полосы 5 нм, и затем проводили измерения флуоресценции. Измерение флуоресценции регистрировали на спектрофлуори-метре Hitachi F7000 («Hitachi», Япония). Затем стационарную флуоресценцию измеряли при возбуждении белка при 295 нм.
Измерение анизотропии флуоресценции при различных значениях pH. Величины анизотропии флуоресценции для растворов белков регистрировались на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse («Varian», США) [13]. Значения стационарной анизотропии определяли по формуле:
r
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.