МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 3, с. 459-469
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 576,321.36+576.382
ИНДУЦИРОВАННОЕ ГИПОКСИЕЙ НАКОПЛЕНИЕ HIF-1 И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА VEGF В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА: РОЛЬ БЕЛКОВ ERK1/2 И PI3K/Akt
© 2008 г. Lili Liu#, Xiaoxuan Ning#, Shuang Han, Hongbo Zhang, Li Sun, Yongquan Shi, Shiren Sun, Changcun Guo, Fang Yin, Taidong Qiao, Kaichun Wu*, Daiming Fan
State Key Laboratory of Cancer Biology, Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, 15 Changle West Road Xi'an, 710032, China
Поступила в редакцию 21.05.2007 г. Принята к печати 25.06.2007 г.
Гипоксия - распространенный стрессовый фактор окружающей среды, воздействующий на сигнальные пути и функции клеток. При этом запуск внутриклеточных сигнальных механизмов ведет к активации транскрипционного фактора HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1). В данной работе подтверждено, что при гипоксии в эпителиальных клетках слизистой желудка усиливается синтез белка HIF-1a. Накопление белка зависит от времени: максимум достигается через 60 мин in vitro и через 4 ч in vivo. Синтез HIF-1a коррелирует с активацией связывания белка HIF-1 с ДНК и повышением его активности в транскрипции. Гипоксия не влияет на синтез мРНК HIF-1a, но регулирует продукцию HIF-1a на уровне трансляции. Гипоксия индуцирует фосфорилирование белков Akt и MAPK (ERK), а также их мишени p70S6K1. Ингибиторы PI3K и MAPK (LY294002 и U0126) подавляют индукцию синтеза HFI-1 и VEGF в ответ на гипоксию. Кроме того, исследовали роль активных форм кислорода (АФК) в индукции синтеза HIF-1 и экспрессии гена VEGF. Добавления экзогенной Н2О2 достаточно для активации Akt и ERK; соединения, нейтрализующие Н2О2, подавляют индукцию Akt и ERK в ответ на гипоксию, а также последующую индукцию синтеза и транскрипционной активности HIF-1a. Выдвинуто предположение, что сигнальный путь гипоксия-PI3K посредством киназ Akt и ERK приводит к АФК-зависимой индуцируемой гипоксией активации HIF-1 и экспрессии гена VEGF в эпителиальных клетках слизистой желудка.
Ключевые слова: гипоксия, ШЕ-1, эпителиальные клетки слизистой желудка, PI3K/Akt, ERK1/2.
HYPOXIA INDUCED HIF-1 ACCUMULATION AND VEGF EXPRESSION IN GASTRIC EPITHELIAL MUCOSA CELL: INVOLVEMENT OF ERK1/2 AND PI3K/Akt, by Lili Liu#, Xiaoxuan Ning#, Shuang Han, Hongbo Zhang, Li Sun, Yongquan Shi, Shiren Sun, Changcun Guo, Fang Yin, Taidong Qiao, Kaichun Wu*, Daiming Fan (State Key Laboratory of Cancer Biology, Institute of Digestive Diseases Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, No. 15 Changle West Road Xi'an 710032, China; *e-mail: kaicwu1962@yahoo.com.cn). Hypoxia is a common environmental stress that influences signaling pathways and cells function, which through initiating intracellular signaling pathways and hence leading to the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). In this study, we initially confirm that hypoxia activates HIF-1a protein expression in a time-dependent manner with a maximum reached at 60 min in vitro and 4h in vivo in gastric mucosa epithelial cells. The expression of HIF-1a is correlated with the activation of HIF-1 DNA binding and transcriptional activity. Hypoxia dose not affect HIF-1a mRNA transcription but regulates HIF-1a protein expression through a translation-dependent pathway to regulate protein synthesis. Hypoxia could induce phosphorylation of Akt, MAPK (ERK), and target of p70S6K1. PI3K and MAPK inhibitor, LY294002 and U0126 could inhibit hypoxia-induced HIF-1 and VEGF expression. We also investigated the role of reactive oxygen species (ROS) involved in HIF-1 and VEGF expression Exogenous addition of H2O2 was sufficient to activate Akt and ERK, scavengers of H2O2 significantly inhibited hypoxia-induced Akt and ERK, and subsequent HIF-1a expression and transcriptional activity. In conclusion, our data suggested that hypoxia-
# Авторы внесли равный вклад в выполнение данной работы.
*Эл. почта: kaicwu1962@yahoo.com.cn
PI3K signaling through Akt and ERK kinases regulated ROS-dependent, hypoxia- induced HIF-1 activation and VEGF expression in gastric mucosa epithelial cells.
Key words: hypoxia, hypoxia-inducible factor-1, gastric epithelial mucosa cell, PI3K/Akt, ERK1/2.
Кислород (02) жизненно важен для клеток млекопитающих. В ходе эволюции клетки приобрели множество молекулярных механизмов, позволяющих им воспринимать физиологические и патофизиологические изменения и реагировать на них [1], что крайне важно для поддержания нормального функционирования и обеспечения жизнеспособности клеток [2, 3]. Ответ клеток на снижение уровня кислорода регулируется фактором HIF-1 (hypoxia-inducible factor 1). HIF-1 - гетеро-димерный белок и состоит из двух субъединиц, HIF-1а и HIF-1P (ядерный переносчик арилгидрокарбо-нового рецептора, ARNT). Обе субъединицы принадлежат к семейству PAS основных белков с доменом helix-loop-helix [4, 5]. На уровне мРНК, гены HIF-1a и HIF-1ft конститутивно экспрессируются при гипоксии [6, 7]. Гипоксия приводит к выраженному повышению уровня HIF-1a за счет снижения его протеасомной деградации, зависящей от кислорода, но не изменяет содержание белка ARNT [8]. Таким образом, при снижении уровня кислорода регулируется только содержание субъединицы HIF-1а. Регуляция в основном определяется посттрансляционной модификацией белка, которая приводит к стабилизации белка, переносу его в ядро и к повышению его ДНК-связывающей и транскрипционной активности [9, 10]. Данный транскрипционный фактор связывается с консервативной регулятор-ной последовательностью, известной как отвечающий на гипоксию элемент (HRE, hypoxia-responsive element), который находится в промоторных участках нескольких генов-мишеней. Один из них кодирует фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF, vascular endothelial growth factor) [11] и представляет собой ключевую транскрипционную мишень HIF-1, опосредующую адаптацию клеток к пониженному уровню кислорода [12].
Кроме того, результаты некоторых исследований указывают на то, что механизмами накопления HIF-1a могут быть активация транскрипции и, возможно, трансляции. PI3K/Akt- и MAPK-зависимые сигнальные пути, приводящие к фосфорилирова-нию важных компонентов аппарата кеп-зависимой трансляции (например, 4E-BP1 и киназы p70 S6), опосредуют накопление HIF-1a в ответ на разнообразные факторы роста, гормоны и цитокины [13, 14]. Соответственно, ингибиторы PI3K/Akt и FFRAP/mTOR (FK506-binding protein-rapamycin associated protein) предотвращают HIF-1-опосредован-ный ответ, вызванный эпидермальным фактором роста, инсулином, фактором некроза опухоли а и некоторыми другими факторами [15-20]. Однако
PI3 K-зависимый путь, по-видимому, специфичен для определенных типов клеток, и его участие в ответе на гипоксию вызывает сомнения [21-27].
Есть данные, что экспрессия гена HIF-1 а активируется не только при гипоксии, но может наблюдаться и при нормальном уровне кислорода при воздействии активных форм кислорода (АФК) -эндогенных или образуемых Helicobacter pylori - на эпителиальные клетки желудка. Недавние исследования на клеточных линиях показали, что АФК, продуцируемые более вирулентными штаммами H. pylori с цитотоксин-ассоциированным геном А (cagA), приводят к стабилизации и накоплению HIF-1a в клетках рака желудка в условиях нормального содержания кислорода [28].
Цель работы - определение роли активации PI3 K/Akt- и MAPK (ERK)-зависимыx путей в индуцированном гипоксией накоплении HIF-1 в эпителиальных клетках слизистой желудка человека (GES). Другая задача исследования - выяснить роль PI3 K/Akt- и MAPK ^^-зависимых путей в HIF-1-зависимой регуляции экспрессии и активности VEGF при гипоксии. Наши результаты показывают, что в клетках GES PI3K/Akt- и MAPK (т)-зависимые пути конститутивно активны при нормальном содержании кислорода и стимуляции эндогенными АФк, приводят к стабилизации HIF-1a и, как следствие, к экспрессии гена VEGF.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии и условия обработки. Линия GES иммортализованных эпителиальных клеток слизистой желудка получена в Пекинском институте рака (Beijing Cancer Institute). Линии клеток поддерживали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную сыворотку теленка, пируват натрия, заменимые аминокислоты, L-глутамин, 2-кратный раствор витаминов ("Life Technologies", США) и смесь пенициллина и стрептомицина, при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.
Реагенты. LY294002, U0126, поликлональные антитела кролика против суммарного или фосфо-рилированного по серину-473 белка Akt человека (Ser473), ERK1/2 (Thr202/Tyr204) и киназы 1 рибо-сомного белка S6, p60 S6K1, и фосфорилированный рибосомный белок S6 (Ser235/236) получены от "Cell Signaling Technology" (США). Ингибиторы растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации, не превышающей 0.1%. Мо-ноклональные антитела мыши против белка HIF-1 человека получены от "BD Biosciences" (США). На-
бор TranAM HIF-1 kit получен от "Active Motif" (США). Прочие реагенты имели квалификацию "чистые для анализа".
Моделирование гипоксии на животных. Мышей подвергали гипоксии (8% атмосферного кислорода) в течение 0-6 ч согласно протоколу [29]. После воздействия слизистую желудка выделяли, рассекая ее вдоль границы брыжейки желудка, промывали и немедленно замораживали до проведения анализа. Все процедуры на животных проводили согласно правилам Совета по обращению с животными Китая, с соответствующей сертификацией.
Вестерн-блот-анализ. Для определения уровня содержания HIF-1 и суммарных или фосфорилиро-ванных белков ERK и Akt целые клетки или слизистую желудка мышей лизировали на льду в течение 30 мин в лизирующем буфере (10 мМ Трис-HCI, pH 8.0, 1 мМ EDTA, 400 мМ NaCl, 10% глицерина, 0.5% NP-40, 5 мМ фторида натрия, 0.1 мМ PMSF, 1 мМ DTT). Равные количества белка (20 мкг) наносили на полиакриламидный гель (8-12%-ный полиакри-ламид) в присутствии додецилсульфата натрия -(ДСН-ПААг), разделяли электрофорезом при 200 V в течение 50 мин и переносили на нитроцел-люлозную мембрану. Неспецифическое связ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.