МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 416-428
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 575.113.5:575.117.2
ИНДУЦИРУЕМЫЕ ДЕКВАЛИНОМ ИЗМЕНЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ ПРЕДШЕСТВУЮТ ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ И АПОПТОЗУ В ЛИНИИ КЛЕТОК РС-3 РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА*
© 2014 г. K. Makowska, M. C. Estañ, I. Gañán-Gómez, M. C. Boyano-Adánez,
A. I. García-Pérez, P. Sancho*
Department of Biology of Systems, University of Alcalá, Alcalá de Henares (Madrid), 28871, Spain
Поступила в редакцию 17.10.2013 г. Принята к печати 18.12.2013 г.
Митохондрии играют центральную роль в разнообразных физиологических и патологических состояниях, ассоциированных с выживанием и смертью клеток. Делокализованные липофильные катионы, такие как деквалин (DQA), накапливаются в раковых клетках, в которые они привлекаются высоким отрицательным трансмембранным потенциалом митохондрий. DQA проявляет сильную противоопухолевую активность в отношении злокачественных клеток разного типа, в том числе клеток РС-3 рака предстательной железы. Инкубация клеток с DQA в концентрации 1.5—100 мкМ в течение 24 и 48 ч снижает их жизнеспособность, что вместе с утратой трансмембранного потенциала митохондрий приводит к увеличению продукции активных форм кислорода и индуцирует смерть клеток по зависимому от кас-пазы 3 апоптотическому пути. Показано, что DQA вызывает зависимую от времени и концентрации смерть клеток, степень которой меняется от умеренной до сильной. Наибольший эффект достигается при инкубации клеток с 10 мкМ DQA в течение 48 ч, что может определяться особенностями кинетики накопления DQA в митохондриях, а также механизмами клеточной смерти, индуцируемой DQA. Эти данные показывают, что DQA можно рассматривать в качестве перспективного агента, который действует на клетки линии РС-3 рака предстательной железы человека и активирует каспазазависимый путь апоптоза. Этот факт указывает на возможные пути применения DQA в терапии рака.
Ключевые слова: митохондрии, апоптоз, деквалин, каспаза 3, активные формы кислорода, предстательная железа, клетки РС-3.
CHANGES IN MITOCHONDRIAL FUNCTION INDUCED BY DEQUALINIUM PRECEDE OXIDATIVE STRESS AND APOPTOSIS IN THE HUMAN PROSTATE CANCER CELL LINE PC-3, by K. Makowska, M. C. Estañ, I. Gañán-Gómez, M. C. Boyano-Adánez, A. I. García-Pérez, P. Sancho* (Department of Biology of Systems, University of Alcalá, Alcalá de Henares (Madrid), 28871, Spain; *e-mail: pilar.sancho@uah.es). Mitochondria play central roles in diverse physiological and pathological conditions associated with cell survival and death. Delocalized lipophilic cations, such as dequalinium (DQA), are accumulated in cancer cells attracted by the highly negative mitochondrial transmembrane potential of these cells. DQA showed a potent anticancer activity in cells from different malignancies. Here, we report the effect of DQA on PC-3 prostate cancer cells. Incubation with DQA at concentrations between 1.5 and 100 ^M from 24 to 48 h decreases cell viability. The decrease in cell viability together with a loss of mitochondrial transmembrane potential induced an increase in reactive oxygen species production and cell death via caspase-3 dependent apo-ptotic pathway. QA was shown to cause moderate to strong cell death in a time and concentration dependent manner, causing a most advantageous effect at a concentration of 10 ^M applied for a long 48 h time period, which might be a consequence of the kinetics of intracellular DQA accumulation in mitochondria, but also of the mechanisms of DQA-induced cell death. This data shows DQA as a promising agent against the human prostate cancer PC-3 cell line, activating the caspase-3 dependent apoptotic pathway. This fact might be beneficial for possible future applications in cancer therapy.
Keywords: mitochondria, apoptosis, dequalinium, caspase 3, ROS, prostate, PC-3. DOI: 10.7868/S0026898414030136
* Эл. почта: pilar.sancho@uah.es
# Статья представлена на английском языке.
Рак предстательной железы — агрессивное заболевание, частота которого возрастает, а эффективные способы терапии не разработаны [1]. С 1970 года получено и описано более 30 линий клеток для изучения рака предстательной железы. Наиболее часто используется андрогеннезависи-мая агрессивная линия клеток РС-3. В связи с нечувствительностью к андрогенам и высокой злокачественностью линия РС-3 представляет собой отличную экспериментальную модель для изучения новых методов терапии рака предстательной железы человека. Существует несколько фармакологических препаратов и их комбинаций, применяемых при гормоннезависимых формах рака предстательной железы [2].
Митохондрии — высокоспециализированные органеллы, связанные с различными физиологическими и патологическими состояниями, включая жизнеспособность и смерть клеток [3, 4]. Утрата трансмембранного потенциала митохондрий, высвобождение проапоптотических белков в цито-золь, активация каспаз, а также физиологические изменения митохондрий, включая аномальную продукцию активных форм кислорода (АФК) и снижение синтеза АТР, участвуют и, по-видимому, отвечают за различные проявления клеточной смерти [4, 5]. В раковых клетках часто наблюдается повреждение различных путей гибели клеток, что способствует их выживанию, поэтому воздействие на митохондрии можно рассматривать как перспективный подход к избирательной атаке на опухоль [6, 7]. Следовательно, в качестве потенциальных противоопухолевых средств можно использовать соединения, действующие на митохондрии [8—10]. Интересно, что в митохондриях некоторых опухолевых клеток накапливаются и задерживаются делокализованные липофильные катионы, такие как деквалин ^ОД), которые привлекаются высоким отрицательным трансмембранным потенциалом митохондрий (Д¥т) опухолевых клеток [9—12].
Хотя механизм действия DQA изучен не до конца, однако известно, что он проявляет мощную противоопухолевую активность в отношении злокачественных клеток разного типа [12—15]. Ранее нами было изучено цитотоксическое действие DQA на лейкозные клетки [16—18]. Оказалось, что DQA по-разному действует на клетки крови больных лейкозом и на клетки здоровых доноров [18]. DQA использовали также для создания так называемых деквасом (DQAsomes) — системы доставки митотропных средств и ДНК в клетки [19, 20].
В представленной работе изучено влияние DQA на линию клеток РС-3 рака предстательной железы. С этой целью определяли трансмембранный потенциал митохондрий, продукцию АФК и гибель клеток по пути апоптоза, в том числе морфологические изменения клеток и образование
отщепляемых при активации каспазы 3 фрагментов протеинкиназы C 8 (PKC-8) и поли(ADP-ри-бозо)полимеразы (PARP).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Линии клеток и культивирование. Клетки PC-3, полученные из ATCC (American Type Cell Collection, USA; CRL-1435), культивировали при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, в среде RPMI 1640 с GlutaMAX™, содержащей 10% термоинактивированной плодной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл ам-фотерицина B.
Приготовление и применение DQA. DQA для обработки клеток готовили как описано ранее [21]. Клетки культивировали примерно 24 ч до использования, что обеспечивало их прикрепление к поверхности флакона. Затем клетки инкубировали в присутствии разных концентраций DQA в течение 24 или 48 ч, в некоторых опытах использовали более короткий промежуток времени (0.5—16 ч). После инкубации клетки обрабатывали трипсином, центрифугировали при 300 g в течение 5 мин и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) до плотности 106/мл.
Определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определяли колориметрическим методом с МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазо-лил)-2,5 -дифенил-2Н-тетразолийбромид, тиазоло-вый синий). Живые клетки с функционирующими митохондриями могли восстанавливать тетразоли-евое кольцо с образованием продукта — синего формазана, тогда как клетки с дисфункцией митохондрий оставались неокрашенными. Повышение интенсивности окрашивания коррелирует с количеством метаболически активных клеток. Жизнеспособность клеток определяли в соответствии с инструкциями фирмы ("Roche Molecular Biochemical", Indianapolis, IN, США). Значение IC50 соответствовало концентрации препарата, при которой жизнеспособность клеток снижается на 50%.
Оценка некротической гибели клеток. Гибель клеток в результате некроза определяли либо по нарушению целостности клеточной мембраны, либо по выходу красителя трипанового синего, либо по свободному включению иодистого про-пидия (PI) в непермеабилизированные клетки. В тесте исключения трипанового синего клетки инкубировали в 0.2%-ном (в/о) растворе трипаново-го синего в течение 5 мин и анализировали микроскопически (OLIMPUS BHT) с использованием гемоцитометра Нейбауэра. Мертвыми считали только явно окрашенные в синий цвет клетки. PI для оценки его накопления добавляли к суспензии клеток до конечной концентрации 20 мкг/мл, эмиссию флуоресценции анализировали методом
проточной цитометрии на приборе FACScan ("Becton Dickinson", San Jose, CA, США) с детектором FL2 (светофильтр 620 нм). В этих условиях некротические клетки ярко окрашиваются PI и выявляются в виде пика с очень высоким уровнем флуоресценции. Апоптотические клетки представлены слабо флуоресцирующей популяцией. Известно, что апоптоз ведет к нарушению целостности цитоплазматической мембраны, поэтому в число клеток, определяемых этим методом как некротические, входят и клетки на поздних стадиях апоптоза.
Оценка апоптотической гибели клеток. Характерную для апоптоза потерю ДНК анализировали с помощью проточной цитометрии пермеабили-зированных клеток, окрашенных PI. Образцы, содержащие (3—5) х 105 клеток, инкубировали с РНКазой А (0.5 мг/мл) в течение 30 мин. Затем клетки пермеабилизировали 0.1%-ным нониде-том P40 (NP40) и инкубировали с 50 мкг/мл PI. Клеточный цикл анализировали с помощью проточной цитометрии (FL2-детектор в линейном режиме) с использованием программ WinMDI и Cylchred. Апоптотические клетки идентифицировали как гиподиплоидный пик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.