научная статья по теме ИНДУЦИРУЕМЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ LUX-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИНДУЦИРУЕМЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ LUX-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 112-117

УДК 578.8

ИНДУЦИРУЕМЫЕ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ LUX-БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОВ: КОНСТРУИРОВАНИЕ И ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ © 2014 г. В. Ю. Котова, К. В. Рыженкова, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,

Москва, 117545 e-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в редакцию 07.08.2013 г.

На основе бактерий Escherichia coli сконструированы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков тетрациклинового и Р-лактамного рядов, квинолонов, а также аминогликозидов. Для создания биосенсоров использовали бактерии, содержащие гибридные плазмиды pTetA'::lux, pAmpC'::lux, pColD'::lux, pIbpA'::lux, в которых транскрипция генов-репортеров luxCDABE Photorhabdus luminescens осуществлялась с индуцируемых промоторов генов tetA, ampC, cda, ibpA соответственно. Определены основные характеристики (пороговая чувствительность, амплитуда и время ответа) lux-биосенсоров. Показана высокая специфичность биосенсоров, реагирующих исключительно на антибиотики определенного вида.

DOI: 10.7868/S0555109914010073

Для обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах в настоящее время, помимо традиционных микробиологических тестов, иммунохи-мических и хроматографических методов, используются биолюминесцентные методы. Биолюминесцентные методы можно разделить на две группы. Первая группа методов основана на токсическом действии антибиотика на бактериальную клетку, что оценивается по снижению интенсивности биолюминесценции клеточной суспензии. В данном варианте в качестве биосенсора используются или природные штаммы светящихся морских бактерий, или бактерии Escherichia co-li, содержащие гибридную плазмиду, в которой гены luxAB, кодирующие люциферазу, расположены под конститутивным промотором [1—6]. Исходно клетки биосенсора ярко люминесциру-ют. При наличии в среде антибиотиков интенсивность биолюминесценции клеток со временем снижается. Эта группа методик является вариантом "Микротокс-теста", широко используемого для детекции в окружающей среде различных токсических агентов. К недостаткам данных методик необходимо отнести неспецифичность анализа, так как помимо антибиотиков токсические вещества различной природы также вызывают снижение интенсивности биолюминесценции. Отметим, что при использовании комбинированного биолюминесцентного метода с дополнительной обработкой клеток биосенсора Escherichia coli TG-1, содержащего плазмиду с lux-опероном Photobacte-rium leiognathi (биосенсор "Эколюм" [7]), сыво-

роткой крови, содержащей антитела к данной группе антибиотиков, авторам работ [5—6] удалось значительно повысить как чувствительность, так и специфичность метода.

Вторая группа биолюминесцентных методик — конструирование индуцируемых специфических lux-биосенсоров [8—11]. В данном варианте бактериальные клетки E. coli содержат гибридную плазмиду с встроенными в нее двумя основными элементами: регуляторной системой (ген-регулятор и промоторно-операторная область) и тран-скрипционно слитой с ней группой генов-репортеров. В качестве генов-репортеров используются гены lacZ (кодирует ß-галактозидазу), ген gfp (кодирует зеленый флуоресцирующий белок), гены luxCDABE, изолированные из геномов светящихся бактерий и кодируюшие люциферазу и редук-тазу, участвующую в биосинтезе субстрата люци-феразы тетрадеканаля. Регуляторные области, возникшие в процессе длительной адаптации бактерий к внешним токсическим агентам, изолируют из геномов различных видов бактерий или из мобильных элементов (транспозоны, плазмиды). В норме (при отсутствии в среде токсического агента) клетки биосенсора с генами-репортерами luxCDABE практически не люминес-цируют, так как белок-регулятор (репрессор) плотно закрывает промотор, и синтез люциферазы отсутствует. При появлении в среде токсического вещества, принадлежащего группе, на которую реагирует данный белок-репрессор, репрессор инакти-

вируется, в результате открывается промотор и начинает синтезироваться белок-репортер. В результате клетки биосенсора, в состав плазмиды которого встроены гены luxAB, кодирующие люци-феразу, начинают люминесцировать, причем интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации токсического вещества в среде, что делает метод не только качественным, но и количественным. Биосенсоры данной группы высоко специфичны, так как реагируют исключительно на определенный класс токсических агентов. Сконструированы lux-биосенсоры для детекции тетрациклина [12], антибиотиков группы Р-лак-тамов [13], низина [14] и эритромицина [15—16].

Цель работы — создание индуцируемых специфических lux-биосенсоров ( с генами-репортерами luxCDABE Photorhabdus luminescens) для детек-циии антибиотиков Р-лактамного ряда, тетра-циклинового ряда, квинолонов (ингибиторов гиразы), аминогликозидов.

МЕТОДИКА

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали штамм Escherichia coli K12 MG1655Z1, хромосома которого содержит ген, кодирующей TetR, белок-репрессор промотора PtetA. Этот штамм получен трансдукцией с помощью фага P1; в качестве донора использовали клетки E. coli DH5aZ1 tetR, в геноме которого ген tetR тесно (90% котранс-дукции) сцеплен с геном, определяющим резистентность бактерии к спектиномицину. Штамм E. coli MG1655 ampC::kanr получен трансдукцией с помощью фага P1; в качестве донора использовали клетки E. coli BW25113 rmB3 AlacX4787 hsdR5114 A(araBAD)563 rph-1 ampC::kanr.

В работе использовали также следующие штаммы E. coli K12: MG1655 F- ilvG rfb-50 rph-1; MC1061 F- araD139 A(ara leu)7697AlacX74 thigalU galKhsdR mcrB rpsL; TG-1 thi relA supE44hsdR17hs-dM Alac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15]; AB1157 F- thr-1 leu-6proA2 his-4 thi-1 argE3 lacY1 galK2 ara14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44. Citro-bacter freundii ATCC 29063 получен от Р.С. Фил-липс (R.S. Phillips, США) [17].

Плазмида pColD-CA23 получена от И.А. Хмель (Институт молекулярной генетики РАН, Москва); векторы pACYC177, pTZ57R фирмы "Fermentas" (Литва), pDEW201 получен от Т.К. Ван Дик (T.K. Van Dyk, США).

Питательные среды и условия роста. Бактерии растили в бульоне Луриа—Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина или 40 мкг/мл кана-мицина. Клетки выращивали в аэрируемых условиях при 30°C до ранней экспоненциальной фазы.

Ферменты и химические вещества. Все химические препараты были аналитической чистоты. В качестве индукторов использовали антибиотики: налидиксовую кислоту, норфлоксацин, тетрациклин, ангидротетрациклин, ампициллин, цефа-ликсин, цефазолин, митомицин С, гентамицин, канамицин фирм "Sigma Chemical Co" (США), "Merk" (Германия), "Biopharm" (Россия). Ферменты для работы с ДНК получены от "Fermentas" (Литва). Все тест-растворы готовили непосредственно перед их использованием.

Конструирование гибридных плазмид. ДНК-

фрагменты, содержащие промоторы PtetA, PampC, Pcda, P¡bpA и соответствующие регуляторные участки, были получены при помощи ПЦР амплификации нуклеотидных последовательностей из генома E. coli K12 MG1655, из транспозона Tn10, из плазмиды pColD-CA23, из генома Citrobacter freundii с использованием соответствующих прайме-ров. На первом этапе полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pTZ57R. Далее фрагменты ДНК, фланкированные сайтами рестрикции EcoRI и BamHI, встраивали по указанным сайтам в беспромоторный вектор pDEW201 (oricolE , ген-маркер bla), в котором они были транскрипционно слиты с генами-репортерами luxCDABE Photorhabdus luminescens. При конструировании гибридной плазмиды pAmpR с фрагментом ДНК из генома С. freundii ген — маркер bla в векторе pDW201 был заменен на ген — маркер kanr (резистентность к канамицину). Вставка фрагмента ДНК размером 985 н.п. и содержащего ген kan из вектора pACYC177 проводилась с использованием следующих праймеров^й

14-nptPstF 5'-ggCTGCAGgctagactgggcggtttat-3'-53 28 bp 14-nptPstR, 5'-ggCTGCAGaagatccccttattagaagaact-52 31 bp.

Сконструированные гибридные плазмиды вводили в клетки различных штаммов E. coli K12. Выделение ДНК плазмид, рестрикцию, лигиро-вание фрагментов ДНК, трансформацию клеток проводили согласно [18].

Измерение люминесцентной реакции lux-био-сенсоров. Ночную культуру биосенсора разводи-

ли до концентрации 107 кл./мл в свежей среде LB и выращивали с аэрацией при 30°С до ранней экспоненциальной фазы. Затем пробы по 200 мкл переносили в специальные кюветы, одна из которых служила контролем (в нее добавляли 4 мкл дистиллированной воды), в другие кюветы вносили по 4 мкл антибиотиков в различной концентрации. Приготовленные таким образом пробы с

отн. ед.

0 5 10 30 60 90 110

мин

Рис. 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции (отн. ед.), индуцируемой тетрациклином, lux-биосенсора E. coli MG1655Z1 (pTetA'::lux) от времени инкубации в среде LB с различными концентрациями антибиотика (нг/мл): 1 - контроль (без добавления антибиотика), 2 - 10, 3 - 20, 4 - 40, 5- 100, 6 - 500.

клетками lux-биосенсора располагали перед фотоумножителем в люминометре LMAO1 ("Beck-man", США) и через определенные интервалы времени измеряли интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. Пробы инкубировали при комнатной температуре. Измерение интенсивности биолюминесценции проводили согласно [8-9].

Измеряли три основных параметра, характеризующих качество биосенсора: амплитуду ответа (АО), минимальное время ответа (tm) и пороговую чувствительность.

Амплитуда ответа АО определялась по формуле: AO = It - Io/Ik- Io, где Io - интенсивность биолюминесценции препарата в момент добавления индуктора (t = 0), Ik - интенсивность биолюминесценции контрольного препарата (отсутствие индуктора) в момент t, It - интенсивность биолюминесценции опытного препарата в момент t.

Минимальное время ответа tm определялось интервалом времени между моментом добавления индуктора и моментом фиксации прибором (люминометром) достоверного усиления сигнала по сравнению с (Ik - I0).

Пороговая чувствительность определялась минимальной концентрацией индуктора, при которой АО равен 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Lux-биосенсоры для детекц

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком