МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 51-56
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 578.262.3+579.842.11:577.152.1
ИНДУЦИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ СИСТЕМЫ ГИПОКСАНТИН-КСАНТИНОКСИДАЗЫ НА ПРОФАГ ЛЯМБДА
© 2004 г. Ш. К. Жу, Ч. К. Фанг1, С. X. Жу, Л. Ж. Жанг, Ч. П. Фан, Д. К. Жанг
Уханъский университет, Колледж наук о жизни, Ухань, 430072, Китай Поступила в редакцию 07.02.02 г.
Система гипоксантин-ксантиноксидаза (ГК-КО) является классической системой, генерирующей супероксидные анионы. В данной работе был исследован индуцирующий эффект этой системы на профаг лямбда. Исследование показало, что ГК-КО может индуцировать профаг лямбда, переводя его из лизогенного состояния в состояние литического цикла. Степень индукции была прямо пропорциональна концентрации гипоксантина и ксантиноксидазы и обратно пропорциональна времени взаимодействия между ГК и КО. Максимальный индуцирующий эффект, который наблюдался при концентрации клеток лизогенного штамма, равной 108/мл, и максимальных использованных концентрациях ГК и КО (0.86 мМ и 0.016 Е/мл соответственно), составлял 2,9 х 104 БОЕ/мл. Глутатион, супероксиддисмутаза и каталаза предотвращали индуцирующий эффект системы ГК-КО. Полученные результаты свидетельствуют о том, что свободные радикалы играют главную роль в индукции профага лямбда в лизогенных бактериях.
Ключевые слова: система гипоксантин-ксантиноксидаза, профаг лямбда, свободные радикалы.
Генерирующая супероксид-анионы система гипоксантин-ксантиноксидаза (ГК-КО) широко используется для изучения физиологической роли супероксидных радикалов [1, 2]. Считается, что ги-поксантин окисляется ксантиноксидазой с образованием активной формы кислорода O2 , которая вызывает переперфузионное поражение тканей [3, 4]. До сих пор, однако, не было данных, что система ГК-КО может влиять на метаболизм и репродукцию бактериальных клеток.
ДНК бактериофага лямбда, интегрированная в хромосому лизогенной бактерии Escherichia coli К12 (X), достаточно стабильна, однако некоторые физические и химические факторы могут индуцировать переход этого бактериофага из лизогенного состояния в состояние литического цикла. В частности, эффективным индуцирующим агентом является ультрафиолетовое излучение [5, 6]. Было показано, что литические гены бактериофага лямбда в процессе лизогенного роста отключаются так называемыми CI белками (реп-рессорами) [7]. Когда лизогенные клетки облучаются ультрафиолетом, соседние пиримидиновые основания образуют димеры. Протеолитическая активность RecA белка, и последний расщепляет CI репрессор, в результате чего бактериофаг переходит в стадию литического цикла [8-10]. В нашей недавней работе [11] мы показали, что гасители свободных радикалов эффективно предотвращают пе-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: cxfang@whu.edu.cn).
реход профага лямбда в литический цикл, индуцированный ультрафиолетом.
В данной работе впервые продемонстрирован индуцирующий эффект системы ГК-КО на профаг лямбда и описана его зависимость от концентрации ГК и КО, от времени взаимодействия между ГК и КО, и от плотности суспензии лизогенных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что свободные радикалы играют главную роль в индукции профага лямбда в лизогенных бактериях, подвергнутых ультрафиолетовому облучению.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и условия культивирования
Лизогенный штамм Escherichia coli К12 (X) и индикаторный штамм Escherichia coli К12 W3001 были получены из Китайского центра типовых культур (China Center for Type Culture Collection, CCTCC) в Ухани, Китай. Штамм E. coli К12 (X) выращивали в течение ночи при 37°С в LB-буль-оне, который содержал (г/л) триптон - 10; дрожжевой экстракт - 5; и NaCl - 10 (pH 7.0). Индикаторный штамм выращивали в YT бульоне, который содержал (г/л) триптон - 8; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 5; мальтозу - 5; и 10 мМ MgSO4 (pH 7.0) [12].
51
4*
Титр лизата, х 104 БОЕ/мл
Объем растворов ГК и КО, мкл
Рис. 1. Зависимость индуцирующего эффекта системы ГК-КО на бактериофаг лямбда от количества добавленного гипоксантина и ксантиноксидазы. Максимальный объем добавленных растворов ГК и КО (70 мкл) соответствует концентрации ГК, равной 123 мкМ, и концентрации КО, равной 2.3 х 10 Е/мл. В контроль было добавлено 140 мкл стерильной дистиллированной воды.
Индукция бактериофага лямбда системой ГК-КО
Клетки ночной культуры лизогенного штамма E. coli К12 (ц) переносили в свежий LB-бульон и инкубировали при 37°С в течение 4-6 ч. Затем их собирали центрифугированием при 4000 g в течение 15 мин (4°С) и суспендировали в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.0). Аликвоту полученной суспензии объемом 1.5 мл помещали в стерильную пробирку и добавляли 0.25 мл 43 мМ гипоксантина ("Sigma"), 0.25 мл раствора ксантинок-сидазы ("Sigma") с активностью 0.8 Е/мл, и 2 мл 2х LB-бульона. Контрольная пробирка не содержала гипоксантин и ксантиноксидазу. Пробирки инкубировали при 37°С в течение 3 ч, после чего добавляли несколько капель хлороформа в каждую пробирку, интенсивно встряхивали в течение 1 мин, и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем содержимое пробирок центрифугировали при 8000 g в течение 15 мин (4°С), и супер-натант, который представлял собой лизат бактериофага лямбда, собирали для последующего анализа [13].
ние 20 мин и добавляли 5 мл расплавленного УТ-агара. После короткого перемешивания, этот полужидкий агар наслаивали на поверхность подогретого УТ-агара в чашке Петри и инкубировали в течение ночи при 37°С. Индуцирующий эффект системы ГК-КО оценивали в БОЕ (бляшкообра-зующая единица) на одну чашку, используя чашки с добавлением 70 мкл раствора ГК и 70 мкл раствора КО в качестве положительных контролей и чашку с добавлением 140 мкл дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля [13].
Оценка влияния некоторых факторов на индуцирующий эффект системы ГК-КО
Влияние концентрации ГК и КО определяли, добавляя их в разной концентрации к 1.5 мл суспензии лизогенных клеток. Затем определяли титр фага как описано выше, используя чашки с добавлением дистиллированной воды или ГК или КО, взятые по отдельности, в качестве контроля.
Влияние времени инкубации ГК и КО друг с другом оценивали, добавляя по 70 мкл растворов ГК и КО в пробирки, содержащие 1.5 мл 2 х ЬБ-бульон. Пробирки инкубировали в течение 0.5, 5, 15, 25 и 45 мин, после чего в каждую пробирку добавляли 1.5 мл суспензии лизогенных клеток, и определяли титр бактериофага лямбда как обычно.
Влияние плотности клеток в суспензии лизо-генного штамма на индуцирующий эффект системы ГК-КО изучали в диапазоне плотностей 1061010 клеток/мл. Растворы ГК и КО объемом 70 мкл помещали в пробирки, содержащие 2 мл 2 х ЬБ-бульон и 1.5 мл суспензии лизогенных клеток, и определяли титр бактериофага лямбда, как описано выше.
Оценка влияния гасителей свободных радикалов
В качестве гасителей использовали супероксид-дисмутазу (СОД) в концентрации 500 Е/мл, катала-зу в концентрации 20000 Е/мл и глютатион. Для этого их смешивали в пробирках, содержащих растворы ГК и КО объемом 70 мкл, 2 мл 2 х ЬБ-буль-она и 1.5 мл суспензии лизогенных клеток, и определяли титр бактериофага лямбда как обычно.
Определение индуцирующего эффекта
Клетки ночной культуры индикаторного штамма E. coli W3001 переносили в свежий YT-бульон, содержащий мальтозу и MgSO4, и инкубировали при 37°С в течение 4-6 ч. Аликвоту этой культуры объемом 0.1 мл помещали в стерильную пробирку и добавляли 0.1 мл лизата бактериофага лямбда (в разной концентрации). Пробирку инкубировали в водяной бане при 37°С в тече-
РЕЗУЛЬТАТЫ
Индукция бактериофага лямбда системой ГК-КО
Как видно из результатов представленных на рис. 1, система ГК-КО эффективно индуцирует переход бактериофага лямбда из лизогенного состояния в состояние литического цикла. Степень индукции тесно зависела от концентрации ГК и КО. Так, при добавлении 10 мкл ГК и 10 мкл КО (конечная концентрация ГК и КО равна 123 мкМ
Титр лизата, х 104 БОЕ/мл
3.5 г
Титр лизата, х 104 БОЕ/мл 3.5 г
0 10 20 30 40
Время прединкубации ГК с КО, мкл
Рис. 2. Зависимость индуцирующего эффекта системы ГК-КО на бактериофаг лямбда от времени прединкубации ГК с КО. 2 х ЬБ бульон (1.5 мл) смешивали в пробирках с 70 мкл растворов ГК и КО, инкубировали в течение 0.5, 5, 15, 25 и 45 мин, после чего в каждую пробирку добавляли 1.5 мл суспензии лизогенных клеток и определяли титр бактериофага в ли-
и 2.3 х 10-3 Е/мл соответственно), титр бактериофага лямбда составлял 5.3 х 103 БОЕ/мл. При добавлении же 70 мкл ГК и 70 мкл КО (конечная концентрация ГК и КО равна 0,86 мМ и 1.6 х 10-2 Е/мл соответственно) титр бактериофага лямбда составлял уже 2.9 х 104 БОЕ/мл. В контроле, который содержал дистиллированную воду или ГК, или КО, бляшки практически отсутствовали.
Влияние времени инкубации ГК и КО друг с другом на индукцию бактериофага
Соответствующие результаты представлены на рис. 2. Видно, что когда прединкубация ГК и КО друг с другом не превышает 5 мин, титр бактериофага лямбда достаточно высокий (2.6-3.0 х х 104 БОЕ/мл). С увеличением времени предын-кубации титр бактериофага быстро уменьшался и становился равным нулю при времени инкубации, равном 45 мин.
Влияние плотности клеток на индукцию бактериофага лямбда
Как видно из рис. 3, титр бактериофага лямбда был максимальным (3.0 х 104 БОЕ/мл), когда плотность клеток лизогенного штамма составляла 108/мл. При меньшей и большей плотности лизогенных клеток титр бактериофага лямбда был ниже. Минимальное значение титра бактериофага наблюдалось при концентрации лизогенных клеток равной 1010/мл.
1010 109 108 107 106 Количество клеток в мм
Рис. 3. Зависимость титра бактериофага лямбда от концентрации лизогенных клеток. 70 мкл растворов ГК и КО, что соответствовало 43 мМ ГК и 0,8 Е/мл КО, смешивали с 1.5 мл суспензии лизогенного штамма, которая содержала 106, 107, 108, 109 и 1010 кл/мл, и определяли титр бактериофага в лизате чашечным методом.
Оценка влияния гасителей свободных радикалов
В качестве таких гасителей использовали су-пероксиддисмутазу, каталазу и глютатион. При концентрации СОД 6.4 Е/мл (объем добавленного раств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.