БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 299-304
УДК 577.345
ИНФРАКРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК 1КРР КАК АКЦЕПТОР ДЛЯ РЕЗОНАНСНОГО ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ВОЗБУЖДЕНИЯ
© 2015 г. О. А. Злобовская*, К. С. Саркисян*, К. А. Лукьянов*, *, **
*Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Научно-исследовательский институт биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина, 10/1 Поступила в редакцию 24.11.2014 г. Принята к печати 08.12.2014 г.
Исследована возможность использования инфракрасного флуоресцентного белка iRFP на основе бактериофитохрома в качестве акцептора для ферстеровского резонансного переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET). В качестве доноров энергии использовали GFP-подобные дальнекрасные флуоресцентные белки mKate2, eqFP650 и eqFP670. С целью тестирования FRET создали генно-инженерные конструкции для экспрессии в бактериях, кодирующие донорный и акцепторный белки, соединенные гептадекапептидным линкером. Эффективность FRET оценивали in vitro на выделенных белках по росту эмиссии донора после разрезания линкера. Из трех тестированных конструкций наиболее эффективный перенос энергии (приблизительно 30%) показала пара eqFP650-iRFP.
Ключевые слова: флуоресцентный белок, GFP, iRFP, генетически кодируемый сенсор, FRET.
DOI: 10.7868/S0132342315030136
ВВЕДЕНИЕ
Благодаря способности к автокаталитическому образованию хромофорной группы флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка (Green Fluorescent Protein, GFP) широко используются в качестве генетически кодируемых меток в биологических исследованиях [1]. На основе природных GFP-подобных белков с помощью направленной молекулярной эволюции in vitro была создана целая панель улучшенных флуоресцентных белков, охватывающая почти весь видимый спектр. Особый интерес для фундаментальных и биомедицинских исследований на модельных животных представляют белки, флуоресцирующие в дальнекрасной и ближней инфракрасной областях спектра, из-за низкой автофлуоресценции и относительно высокой прозрачности тканей позвоночных в этом диапазоне [2]. На основе GFP-подобных белков были получены дальнекрасные флуоресцентные белки с максимумами возбуждения при 590—610 нм и
Сокращения: GFP — зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein); FRET — ферстеровский резонансный перенос энергии (Förster (or fluorescence) resonance energy transfer); iRFP — инфракрасный флуоресцентный белок, (infrared fluorescent protein).
# Автор для связи (тел.: +7(499) 742-81-22; эл. почта: kluk@ibch.ru).
максимумами эмиссии при 630—670 нм [3—8]. Дальнейшего продвижения в красную область удалось добиться путем создания флуоресцентных белков на основе бактериофитохромов [9]. Эти белки ковалентно связывают биливердин IXa в качестве простетической группы. С помощью направленной молекулярной эволюции удалось получить варианты бактериофитохромов, флуоресцирующие в ближней инфракрасной области спектра (возбуждение при 660—690 нм, эмиссия при 680—720 нм) [9—12].
Спектральное разнообразие флуоресцентных белков используют для многоцветного мечения, позволяющего визуализировать различные структуры в одних и тех же клетках. Кроме того, подходящие пары флуоресцентных белков используют для анализа белок-белковых взаимодействий и создания флуоресцентных сенсоров на основе эффекта ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) [13, 14]. FRET заключается в том, что возбужденный флуорофор-донор вместо эмиссии света резонансно передает свою энергию флуоро-фору-акцептору, который излучает квант света или расходует энергию в тепло.
Для эффективного протекания FRET между двумя флуорофорами необходимо соблюдение нескольких ключевых условий [13, 14]. Во-первых, спектр эмиссии одного флуорофора (донора)
300 ЗЛОБОВСКАЯ и др.
Свойства флуоресцентных белков, использованных в работе
Название белка Максимум возбуждения, нм Максимум эмиссии, нм Молярный коэффициент поглощения, М-1 см-1 Квантовый выход флуоресценции Олигомерное состояние
iRFP 690 713 105000 0.06 Димер
mKate2 588 633 62500 0.40 Мономер
eqFP650 592 650 65000 0.24 Димер
eqFP670 605 670 70000 0.06 Димер
должен существенно перекрываться со спектром поглощения другого (акцептора). Во-вторых, молекулы донора и акцептора должны располагаться близко друг к другу (обычно не дальше 5—8 нм), т.к. эффективность FRET падает пропорционально шестой степени расстояния между флуорофорами. Кроме того, эффективность переноса энергии зависит от взаимной ориентации дипольного момента эмиссии донора и дипольного момента поглощения акцептора. Максимальная эффективность достигается при параллельной ориентации диполей и минимальная — при перпендикулярной. Об эффективности FRET можно судить по уменьшению интенсивности флуоресценции донора, уменьшению времени жизни возбужденного состояния донора, увеличению интенсивности флуоресценции акцептора при возбуждении донора и некоторым другим спектральным характеристикам.
iRFP — димерный инфракрасный флуоресцентный белок, созданный в 2011 году на основе бактериального фитохрома RpBphP2 из Rhodopseudomonas palustris [10]. iRFP имеет максимумы возбуждения и излучения при 690 и 713 нм соответственно, молярный коэффициент поглощения 105 000 М-1 см-1 и квантовый выход флу-
Рис. 1. Нормированные спектры эмиссии белков шКа1е2, едРР650 и едРР670, и спектр поглощения белка гЯРР.
оресценции 0.06 (таблица). iRFP является одним из самых ярких и стабильных белков этого типа, и поэтому активно используется для биоими-джинга на целых животных [15—18]. Теоретически, iRFP и другие инфракрасные флуоресцентные белки являются удобными акцепторами для FRET Однако на сегодняшний день это не было проверено экспериментально.
В данной работе мы изучили возможность использования iRFP в качестве FRET-акцептора в паре с некоторыми дальнекрасными флуоресцентными белками семейства GFP
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для тестирования в качестве FRET-доноров мы выбрали три дальнекрасных флуоресцентых белка, для которых iRFP подходит в качестве акцептора: мономерный mKate2, димерный eqFP650 и димерный eqFP670 (таблица). Для всех трех белков наблюдается существенное перекрывание их спектров эмиссии со спектром поглощения iRFP (рис. 1), что позволяло ожидать эффективный перенос энергии между ними.
В качестве модели для тестирования FRET мы использовали стандартную конструкцию генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров активности каспазы-3. В таких конструкциях два флуоресцентных белка, составляющих FRET-па-ру, соединены пептидным линкером, несущим сайт узнавания каспазы-3 [19—23]. Такой дизайн удобен по нескольким причинам. Во-первых, имеется два четко определяемых состояния (до и после разрезания линкера каспазой), характеризующихся эффективным FRET или полным отсутствием FRET из-за необратимой диссоциации донора и акцептора соответственно. Во-вторых, модульная конструкция сенсора позволяет сравнивать различные флуоресцентные белки. В-третьих, анализ сенсора можно проводить как in vitro на выделенных белках, так и в живых клетках при активации в них апоптоза. Помимо этого, создаваемые новые сенсоры каспазы-3 могут дополнить палитру имеющихся молекулярных инструментов изучения апоптоза.
ИНФРАКРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК iRFP КАК АКЦЕПТОР
301
Дальнекрасные варианты сенсора активности каспазы-3 сконструировали, взяв за основу каспаз-ный сенсор Casper3-GR (Evrogen), который включает белки TagGFP и TagRFP в качестве FRET-па-ры [22]. В новых конструкциях донор TagGFP заменяли на дальнекрасные белки mKate, eqFP650 или eqFP670, а акцептор TagRFP — на iRFP, оставляя между белками FRET-пары линкер "с3" с сайтом узнавания каспазой-3. В качестве вектора использовали плазмиду pQE-30.
Полученные конструкции каспазных сенсоров, обозначенные mKate2-с3-iRFP, eqFP650-c3-iRFP и eqFP670-c3-iRFP, были экспрессированы в бактериях. В норме, в клетках E. coli не содержится достаточной концентрации биливердина IXa, чтобы обеспечить флуоресценцию экспрес-сируемых бактериофитохромов. Для экспрессии полученных нами конструкций мы оптимизировали протокол [24], разработанный для генно-инженерных работ с бактериофитохромами. Вкратце, клетки E. coli котрансформировали плазмидой, несущей вариант сенсора, и плазмидой, кодирующей гем-оксигеназу — фермент, превращающий присутствующий в клетках E. coli гем в биливердин IXa. Для усиления продукции гема бактерии выращивали в присутствии предшественника гема — 8-аминолевулиновой кислоты.
Для конструкции каспазного сенсора mKate2-с3-iRFP наблюдали плотно растущие колонии синего цвета, флуоресцирующие в красной области спектра при анализе с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. На чашках с конструкциями сенсоров eqFP650-c3-iRFP и eqFP670-c3-iRFP при тех же условиях трансформации плотность колоний была существенно ниже и колонии не проявляли окраски. Флуоресценцию наблюдали только для отдельных колоний. Предположительно, из-за димерных свойств как обоих белков-доноров, так и акцептора, сенсоры могли частично агрегировать и формировать тельца включения, препятствуя росту бактерий.
Для анализа спектральных свойств полученных сенсоров, проводили их очистку из фракции растворимых белков с помощью металл-аффинной хроматографии. Флуоресцентная спектроскопия показала, что в составе полученных каспазных сенсоров для каждого донора и акцептора сохраняются их естественные максимумы возбуждения и эмиссии (рис. 2). Для акцепторного белка в спектре возбуждения всех трех вариантов сенсора дополнительно присутствует пик, соответствующий максимуму возбуждения белка-донора (рис. 2, правые спектры). Соответственно, при возбуждении до-норного белка (в области его максимума возбуждения) в спектре флуоресценции присутствовует пик, соответствующий максимуму флуоресценции акцепторного белка (рис. 2, левые спектры).
Для определения эффективности FRET мы измеряли спектры флуоресценции сенсоров до и после обработки каспазой-3. Три варианта сенсора показали общую тенденцию изменения сигн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.