ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2010, том 84, № 1, с. 126-130
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ =
УДК 577.150.3
ИНГИБИРОВАНИЕ ß-ГАЛАКТОЗИДАЗ МОНО- И ДИСАХАРИДАМИ © 2010 г. О. С. Пилипенко, Л. Ф. Атякшева, Е. С. Чухрай
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет
E-mail: alacto@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 16.10.2008 г.
Показано, что в реакции гидролиза модельного субстрата (2-нитрофенил^^-галактопиранозид) неконкурентными ингибиторами ß-галактозидазы из E. coli являются моносахариды с разнонаправленным, как у D-глюкозы, положением гидроксильных заместителей у соседних углеродных атомов в фуранозном кольце — D-фруктоза и D-ксилоза; в случае грибных ß-галактозидаз P. cane-scens и A. oryzae D-галактоза является более сильным конкурентным ингибитором (K¡ = 3.5 и 7.0 мМ соответственно). Установлено, что константа ингибирования максимальна в случае наиболее активного фермента (E. coli) и минимальна для наименее активного (P. canescens).
р-Галактозидазы — ферменты, участвующие в углеводном обмене растений, микроорганизмов, животных и человека. Одна из функций р-галакто-зидаз в организме млекопитающих — гидролиз молочного сахара лактозы. Помимо гидролитической функции р-галактозидазы обладают также транс-гликозидазной активностью и участвуют в синтезе олигосахаридов. Обе каталитические функции р-галактозидаз находят практическое применение, поэтому исследование влияния моно-, ди- и олигосахаридов на их каталитическую активность представляет большой интерес. В литературе имеются неоднозначные сведения о влиянии различных моносахаридов на гидролитическую активность р-галактозидаз. Так, например, Э-галак-тоза (один из продуктов гидролиза лактозы), как правило, считается конкурентным ингибитором р-галактозидаз [1—4]. В то же время в некоторых исследованиях показано, что этот моносахарид не влияет на ферментативную активность р-галакто-зидазы [5, 6], или же он классифицирован как ингибитор смешанного типа [7]. Э-глюкоза — второй продукт гидролиза лактозы — обычно не является ингибитором гидролазной активности р-галакто-зидаз [6, 8, 9], хотя отмечается и ее ингибирующее действие [1, 4, 5]. Данные о влиянии некоторых других моно- и дисахаридов (Э-фруктоза, Э-кси-лоза, Э-манноза, лактоза) на каталитическую активность р-галактозидаз также противоречивы [6,
10, 11]. В связи с этим задача настоящей работы — сравнить действие различных моно- и дисахаридов на ß-галактозидазу из одного источника, а также действие одного и того же моносахарида на ß-га-лактозидазы из различных источников.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объектов исследования выбраны бактериальный фермент из Escherichia coli (E. coli) и грибные ß-галактозидазы Penicillium canescens (P. canescens) и Aspergillus oryzae (A. oryzae). Некоторые свойства исследованных ß-галактозидаз приведены в табл. 1.
Исследования по ингибированию ферментов проводили при комнатной температуре в их рН-оптимуме активности, использовали 0.1 М фосфат-фосфатные (рН 7.5) и фосфат-цитратные (рН 4.5) буферные смеси. Для определения активности использовали синтетический субстрат (2-нитрофенил^-Э-галактопиранозид (о-НФГ)), окрашенный продукт гидролиза которого (2-нит-рофенол) определяли колориметрически при X = = 400 нм. При определении активности грибных ß-галактозидаз (кислая среда) перед колориметри-рованием для развития характерной окраски 2-нитрофенола к отобранной из реакционной смеси пробе добавляли 1 М раствор Na2CO3. Концентрацию субстрата варьировали в пределах 0.05—1 мМ,
Таблица 1. Свойства исследованных ß-галактозидаз
Источник фермента Содержание белка, % Оптимум рН KM, мМ V, мкмоль/(мин мг белка) V/Km
Бактерии E.coli (Sigma) 80 7.5 0.1 15.0 150
Грибы P. canescens (Биотехника) 15 4.5 1.0 16.8 16.8
Грибы A. oryzae (Sigma) 10 4.5 1.6 62.8 39.3
а концентрации ингибиторов в следующих пределах: лактоза 0.25—1.25 мМ, галактоза 2.5—80 мМ, глюкоза 20—800 мМ, фруктоза 50—500 мМ, сахароза 50-300 мМ, ксилоза 100-300 мМ.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Самый распространенный тип ингибирования ß-галактозидаз галактозой (продукт реакции гидролиза дисахарида) — конкурентное ингибирова-ние. Наиболее простое объяснение этого типа ингибирования сводится к тому, что ингибитор связывается с тем же самым центром молекулы фермента, что и субстрат с образованием непродуктивного комплекса. Другими словами, субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же центр связывания, и, следовательно, может образоваться только один комплекс фермента с ингибитором — EI. Концентрация этого комплекса определяется истинной константой равновесия K = [E]0[I]/[EI], которую называют константой ингибирования.
Полное уравнение для стационарной скорости в случае простого конкурентного ингибирования имеет следующий вид:
v =-rn-. (1)
Km (1 + [ I ] / K ) + [S]
Здесь v — начальная скорость ферментативной реакции, [S] и [I] — соответственно концентрации субстрата и ингибитора, а V и KM — максимальная скорость и константа Михаэлиса. Уравнение (1) можно записать как
V = Гэф [ S ] / ( Km, эф + [ S ]), (2)
где Уэф и KM, эф — эффективные значения параметров V и KM, которые определяются следующими выражениями: Уэф = V, а KM, эф = KM(1 + [I]/Kt). Влияние конкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции состоит в том, что он увеличивает KM в (1 + [I]/Kt) раз, уменьшает в то же число раз значение V/KM и оставляет без изменения величину V, что и продемонстрировано на рис. 1 для случая ингибирования ß-галактозидазы из E. coli галактозой и лактозой. Из рисунка видно, что линейные анаморфозы уравнения Михаэлиса—Ментен в присутствии различных начальных концентраций ингибитора пересекаются в одной точке на оси ординат, максимальная скорость (V) составляет 15 мкмоль (о-НФГ)/(мин мг белка). Эффективные значения константы Михаэлиса, как видно из рис. 1, увеличиваются с ростом концентрации конкурентного ингибитора — галактозы или лактозы. Аналогичные результаты получены и для грибных ß-галактозидаз P. canescens и A. oryzae: галактоза является конкурентным ингибитором этих ферментов.
Поскольку величина V в уравнении Михаэлиса—Ментен не является фундаментальной харак-
1/ V, [мкмоль/(мин мг белка)] 1
*10
(а)
мМ-1
Рис. 1. Зависимости скорости гидролиза о-НФГ р-га-лактозидазой из Е. свН в отсутствие (1) и в присутствии галактозы (а: 2 - 2.5, 3 - 5, 4 — 10, 5 — 15, 6 —20, 7- 30, 8 - 40, 9 - 50, 10 - 80 мМ), лактозы (б: 2 - 0.25, 3 - 0.50, 4 - 0.75, 5-1.0, 6 - 1.25 мМ) в координатах Лайнуивера-Берка. Конкурентное ингибирование.
теристикой фермента, так как зависит от его концентрации, то полезно использовать величину У/Км, которая при низких концентрациях субстрата является константой скорости реакции Е + + 8 —► Е + Р. В случае ингибирования можно записать соотношение
Vэ
эф
V/ к
м
M, эф
1 + [ I ] / к
(3)
используя которое легко получить численное значение константы конкурентного ингибирования.
Для исследованных бактериальной ß-галактозидазы из E. coli и грибных ß-галактозидаз из A. oryzae и P. canescens значения констант ингибирования составляют 14.0, 7.0 и 3.5 мМ соответственно. Сравнение величин V/KM (табл. 1) показывает, что наиболее эффективным катализатором в реакции гидролиза модельного субстрата о-НФГ
128
ПИЛИПЕНКО и др.
Таблица 2. Тип ингибирования (I — конкурентный, II —неконкурентный, III — бесконкурентный) и значения констант ингибирования (Kj, мМ) ß-галактозидазы из E. coli моно- и дисахаридами
Ингибитор Тип ингибирова-ния Ki Ингибитор Тип ингибирова-ния Kj
Галактоза I 14.0 Глюкоза II 440
Лактоза I 1.2 Ксилоза II 525
Сахароза III 80 Фруктоза II 500
является ß-галактозидаза из E. coli, а наименее — из P. canescens. Аналогичное изменение констант конкурентного ингибирования этих ферментов галактозой указывает на более высокое сродство конкурентного ингибитора галактозы к ß-галакто-зидазе из P. canescens в ряду изученных ферментов.
В табл. 2 приведены результаты исследования ингибирующего воздействия различных моно- и дисахаридов на ß-галактозидазу из E. coli.
Еще одним конкурентным ингибитором (см. рис. 1 и табл. 2) ß-галактозидазы в реакции гидролиза о-НФГ является ее природный субстрат — лактоза, причем — наиболее сильным (Kj = 1.2 мМ). Второй продукт реакции гидролиза — D-глюкоза, как оказалось (рис. 2), — типичный неконкурентный ингибитор. Понятие "неконкурентное инги-бирование" впервые было введено в ферментативную кинетику Михаэлисом и его сотрудниками для описания случая, когда ингибитор снижает каталитическую эффективность фермента (V), но не оказывает влияния на связывание субстрата. Этот тип ингибирования значительно менее распространен, чем конкурентное ингибирование. В простейшем случае выполняются следующие соотношения:
= F , Эф 1 + [ I ] K (4)
KM, эф _ KM, (5)
Пф _ V/Km KM, эф 1 + [ I] /Ki (6)
Данные рис. 2 представляют собой убедительную иллюстрацию неконкурентного типа ингибирова-ния ß-галактозидазы из E. coli моносахаридами — глюкозой, фруктозой и ксилозой. Вычисленные из этих данных значения константы ингибирования достаточно велики (0.44, 0.53 и 0.50 соответственно) и мало отличаются друг от друга. Механизм неконкурентного ингибирования представить достаточно сложно, поскольку он предполагает, что ингибитор снижает каталитическую активность фермента, но не влияет на связывание субстрата. Можно допустить, что моносахариды практически в равной мере изменяют микроокружение в области активного центра ß-галактозидазы в результате неспецифического связывания в алло-стерическом центре.
Рассмотрим возможные причины различия в механизмах ингибирования ß-галактозидазы исследованными моносахаридами. Гексозы (D-глю-коза и D-галактоза) образуют пространственную структуру в виде шестичленного кольца — пира-нозы (рис. 3). Гидроксильные заместители у С3— С4-связи в пиранозном кольце D-глюкозы разно-направлены, а у D-галактозы — однонаправлены. Это единственное различие в структуре моносахаридов, по-видимому, и определяет их связь с ферментом в активном центре для D-галактозы или аллостерическом — для D-глюкозы. Следствием такого связывания является различие в ме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.