БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 2, с. 187 - 195
УДК 577.24
ИНГИБИРОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ МИТОХОНДРИАЛЬНО НАПРАВЛЕННЫМИ АНТИОКСИДАНТАМИ СЕМЕЙСТВА SkQ*
© 2014 Е.О. Омарова**, Ю.Н. Антоненко
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, НИИМитоинженерии, 119991 Москва; факс: (495)939-3181, электронная почта: omarova@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 28.10.13 После доработки 12.11.13
Изучено влияние антиоксидантов семейства 8кр1 (10-(6'-пластохинонил)децил-трифенилфосфоний) на окислительный гемолиз эритроцитов, индуцированный липофильным азоинициатором 2,2'-азо-ди(2,4'-ди-метилвалеронитрилом) (АМУЫ) и водорастворимым азоинициатором свободных радикалов 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлоридом (ААРН). Показано, что 8кр1 обладает способностью защищать эритроциты от гемолиза, причем при концентрации 2 мкМ защитный эффект максимален. Окисленная форма, наряду с восстановленной, также проявляла защитное действие. Как в восстановленной, так и в окисленной форме, 8кр1 ингибировал перекисное окисление липидов, индуцированное липофильным азоинициатором АМУЫ в эритроцитах, которое регистрировалось по накоплению малонового диальдегида (МДА). При этом в случае индукции окисления эритроцитов ААРН накопление МДА не тормозилось под действием 8кр1. Родаминовый аналог оказывал сопоставимый защитный эффект при ААРН-инду-
цированном гемолизе в концентрации 0,2 мкМ. При больших концентрациях защитное действие уменьшалось, что обусловлено способностью 8кр1 и вызывать гемолиз эритроцитов в отсутствие азоиници-атора. Показано, что пластохинон окисленной формы 8кр1 способен восстанавливаться эритроцитами, что обуславливает его протекторное действие. Таким образом, защитное действие на системе эритроцитов, лишенных митохондрий, происходит при концентрациях, которые на два-три порядка превышают те, которые проявляли активность в системе выделенных митохондрий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антиоксиданты, окислительный стресс, 8кр1, гемолиз, перекисное окисление липидов, эритроциты, ААРН, АМУЫ.
В нормальных физиологических условиях активным формам кислорода (АФК), образующимся в клетке, противостоит ее многокомпонентная антиоксидантная ферментная система. Нарушение существующего баланса, например, в случае наличия экзогенных источников АФК, приводит к окислительному стрессу клеток. Мишенью АФК являются многие клеточные компоненты: нуклеиновые кислоты, белки,
Принятые сокращения: SkQ1 — 10-(6'-пластохино-нил)децил-трифенилфосфоний, SkQRl — 10-(пластохино-нил)децилродамин 19, ААРН — 2,2'-азобис(2-метилпропио-намидин) дигидрохлорид, AMVN — 2,2'-азоди(2,4'-диме-тилвалеронитрил), МДА — малоновый диальдегид, ПОЛ — перекисное окисление липидов, АФК — активные формы кислорода.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-303, 12.01.2014.
** Адресат для корреспонденции.
мембранные липиды. Усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается изменением структуры и свойств биологических мембран и функционирования клеток. Нарушение липидного гомеостаза митохондриальных и клеточных мембран способствует инициации апоптоза или некроза клетки. Следствием окислительного стресса биологических молекул, мембран и тканей являются патологические явления в организме, которые впоследствии инициируют многие болезни (ишемическая болезнь сердца, инсульт, болезнь Альцгеймера, Паркин-сона и др.) [1—3] и старение [4].
Митохондриально-направленные антиоксиданты семейства способные накапливаться в энергизованных митохондриях и защищать клетки животных от последствий окислительного стресса, показали свою высокую антиоксидант-ную активность на таких системах, как искусственные липидные мембраны (липосомы и
плоские бислои), выделенные митохондрии, культуры клеток и модели in vivo [5—7]. Это приводит к анти-апоптотическому действию данного ряда соединений, которое было показано в частности на культуре человеческих клеток HeLa, где SkQ1 проявляет защитное действие от АФК-индуцированного апоптоза уже в нано- и пикомолярных концентрациях [6].
Эритроциты млекопитающих являются традиционной моделью, которая широко используется для изучения механизмов и последствий окислительного стресса, а также защитного действия новых антиоксидантов [8]. Отсутствие других мембранных систем, кроме плазматической мембраны, роднит эту модель с искусственными модельными объектами (липосомами, плоскими бислойными мембранами), которые используются при изучении окислительного повреждения мембран [8—10]. Однако в отличие от липосом, плазматическая мембрана эритроцитов состоит из природных липидов, кроме того эти липиды контактируют с цитоплазмой, которая содержит большинство ферментов, входящих в систему антиоксидантной защиты клеток. В частности, таких белков, как глютатион-пе-роксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза и других. Изучение антиоксидантного действия какого-то соединения ведется не только по способности ингибировать накопление ПОЛ в мембранах в эритроцитах, но и по такому параметру, как защита от гемолиза, вызванного окислительным стрессом [8]. В настоящей работе было исследовано антиоксидантное действие SkQ1 и его аналогов при окислительном стрессе эритроцитов человека, кроме того было изучено их протекторное действие при окислительном гемолизе эритроцитов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Митохондриально-направленные антиокси-данты семейства SkQ1 были синтезированы в нашем институте Г.А. Коршуновой и Н.В. Сум-батян, как описано в [6]. Восстановленную форму SkQ1red готовили перед опытом путем добавления спиртового раствора боргидрида натрия NaBH4 к окисленной форме SkQ1ox. Остальные реактивы были от Sigma-Aldrich.
Образцы крови от здорового донора помещали в натрий-фосфатный буфер (PBS), рН 7,4, содержащий ЭДТА (1 мМ); эритроциты в последующем дважды промывали PBS без ЭДТА и ре-суспендировали в PBS до значения гематокрита 5-10%.
Для инициации гемолиза в качестве индуктора окислительного стресса использовали ли-
пофильный азоинициатор 2,2'-азо-ди(2,4'-ди-метилвалеронитрил) (AMVN). Гемолиз вызывали внесением азоинициатора (4 мМ AMVN) в 2,5%-ную суспензию эритроцитов (гематокрит) и инкубацией при 37° при периодическом перемешивании. Гемолиз регистрировали по выходу гемоглобина, который определяли после осаждения при 3000 об/мин (5 мин) по поглощению гемоглобина при 540 нм на спектрофотометре Ultrospec 1100 фирмы «Amersham». Полный гемолиз вызывали добавлением 1%-ного тритона. Опыты проводили в 3-кратной повторности.
Для инициации гемолиза в качестве индуктора окислительного стресса использовали также водорастворимый азоинициатор 2,2'-азо-бис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (ААРН). Гемолиз вызывали внесением азоинициатора (40 мМ ААРН) в 0,1%-ную суспензию эритроцитов (гематокрит) и инкубацией при 37° при постоянном перемешивании. Гемолиз регистрировали по снижению поглощения света суспензией эритроцитов при 650 нм на спектрофотометре Ultrospec 1100 фирмы «Amersham». Скорость гемолиза характеризовали полувременем гемолиза — временем, за которое значение поглощения достигало половинного значения. Для получения статистически достоверных результатов эксперименты по гемолизу проводили в 4-6-кратной повторности.
Оценку перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициированного азоинициаторами AMVN или ААРН, осуществляли по уровню накопления малонового диальдегида (МДА), который регистрировали по флуоресценции окрашенного аддукта с тиобарбитуровой кислотой согласно [11].
5-10%-ную суспензию эритроцитов человека в буфере PBS, рН 7,4, инкубировали в окислительных условиях (4 мМ AMVN или 80 мМ ААРН) в присутствии и в отсутствие антиоксидантов при 37° в течение 2,5 ч, периодически встряхивая. После добавления трихлоруксусной кислоты (3,4%) суспензию хорошо встряхивали на вортексе и осадок отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 10 000 об/мин. Далее последовательно добавляли тиобарбитуровую кислоту (0,35%) и HCl (0,07 M). Смесь кипятили на водяной бане в течение 30 мин. Измерение флюоресценции при 550 нм (возбуждение 515 нм) проводили на флюориметре Панорама флюо-рат-02 («Люмекс», Россия). Для калибровки метода использовали реакцию с 1,1,3,3-тетраэток-сипропаном. Содержание МДА нормировали на количество гемоглобина, который определяли спектрофотометрически при 540 нм, используя коэффициент экстинкции 13,8 мМ-1 • см-1. Опыты проводили в 4-кратной повторности.
Восстановление окисленной формы 8кр1 (максимум поглощения при 274 нм) в эритроцитах в РВ8 и появление восстановленной формы 8кр1 (поглощение в области 290 нм) регистрировали [6] на спектрофотометре икггерес 1100 фирмы «АтегеИат». Окисленную форму 8кр1 (2 мкМ) инкубировали с суспензией эритроцитов в течение 5 мин, осадок отделяли центрифугированием. Для дальнейшего окисления образовавшейся восстановленной формы 8кр1 использовали 0,006%-ную перекись водорода. Опыты проводили в 3-кратной повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Окислительный гемолиз эритроцитов, индуцированный липофильным азоинициатором AMVN.
Инкубация эритроцитов с липофильным азо-инициатором AMVN (4 мМ) приводит к их значительному гемолизу в течение 2,5 ч (контрольный столбец К, рис. 1). Гемолиз регистрировали в супернатанте по поглощению гемоглобина спектрофотометрически при 540 нм. Из рис. 1 видно, что добавление окисленной формы SkQ1ox в концентрации 2 мкМ в суспензию эритроцитов оказывало защитное действие. Снижение протекторного действия SkQ1 при концентрациях, превышающих 2 мкМ (4 и 20 мкМ), как будет показано далее, связано с его способностью вызывать гемолиз эритроцитов в отсутствие окислительного стресса (при высоких концентрациях). Добавление 3 мМ классического антиоксиданта тролокса вызывало защиту от окислительного гемолиза.
Антиоксидантное действие SkQ1 на системе эритроцитов. Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по накоплению малонового диальдегида (МДА) спустя 2,5 ч после добавления липофильного азоинициатора AMVN или водорастворимого азоинициатора AAPH с целью получения знач
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.