ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 398-406
УДК 577.172.3
ИНГИБИРОВАНИЕ УРЕАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКИМИ ß-ТРИКЕТОНАМИ И ФТОРИД-ИОНОМ
© 2004 г. Е. И. Тарун, Д. Б. Рубинов, Д. И. Метелица
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, 220141; e-mail: metelitza@iboch.bas-net.by Поступила в редакцию 30.01.2003 г.
Изучено конкурентное ингибирование уреазы соевых бобов в водном растворе, при 36°C, pH 7.4, 11 циклическими ß-трикетонами и количественно охарактеризовано константой ингибирова-ния KI, которая сильно зависит от структуры органических хелатирующих агентов атомов никеля уреазы и изменяется в пределах 58.4-847 мкМ. В тех же условиях аналог субстрата - гидроксимоче-вина является слабым ингибитором уреазы (Ki = 6.47 мМ). При 20°С конкурентное ингибирование уреазы лигандом атомов никеля - фторид-анионом сильно зависит от рН водных растворов в интервале 3.85-6.45 и характеризуется величинами K, равными 36.5-4060 мкМ при указанных рН. Наиболее перспективными ингибиторами уреазы являются 3 нетоксичных циклических ß-трикетона с величинами Ki при 36°С, равными 58.4; 71.4 и 88.0 мкМ соответственно, эффективность которых определяется наличием 3 >С=0-групп в молекуле и минимальными стерическими препятствиями при связывании с металлоцентрами уреазы соевых бобов.
Уреаза из соевых бобов (КФ 3.5.1.5) - гомогек-самерный фермент, содержащий 6 субъединиц с мол. массой 90 770 Да и по 2 атома никеля в каждой субъединице, катализирует гидролиз мочевины водой (уреолиз) с образованием катионов аммония и карбонат-анионов [1]:
H2N-CO-NH2 + 2H2O
2N H+ + HC O3
Уреаза из разных источников широко используется при определении мочевины в биоаналитических методах и в иммуноферментном анализе в качестве маркера многих антигенов [2, 3]. В нашей лаборатории ранее изучена кинетика урео-лиза, каталитическая активность и стабильность уреазы в разных средах [4-8]. Несмотря на большую важность уреазы в биотехнологии, анализе и медицине, детальный механизм уреолиза до сих пор не установлен, а структура металлоцентра точно не известна [1, 9, 10].
Активация и ингибирование уреазы является одним из важных инструментов изучения механизма действия этого фермента. Краткий обзор основных групп ингибиторов уреазы, особенностей и эффективности ее действия сделан нами в ранее опубликованной работе [11]. В настоящее время установлено, что уреаза продуцируется многими микроорганизмами и непосредственно связана с такими патологиями, как язва двенадца-
Сокращения: ДМФ - диметилформамид; ГМ - гидроксимо-чевина; ЦТК - циклические трикетоны; 1п - ингибиторы уреазы; К - константа ингибирования, М; Vo - начальная скорость реакции.
типерстной кишки и желудка, а также с рядом заболеваний мочевых путей человека и животных [10, 12-14]. Так как между ингибирующими свойствами одних и тех же веществ для уреазы микробного и растительного происхождения существует четкая корреляция, первичный отбор потенциальных ингибиторов уреазы проще и быстрее проводить при использовании каталитически активной уреазы соевых бобов [9, 10, 15].
Среди многочисленных ингибиторов уреазы видное место принадлежит лигандам-хелаторам никеля органической и неорганической природы: показано, что некоторые пептиды проявляют значительную ингибирующую эффективность (К = (3.0-4.7) х 10-5 М) [16], а среди неорганических соединений наиболее известен как лиганд никеля анион Б- [17, 18].
Ранее в качестве ингибиторов уреазы нами изучены аналоги субстрата (мочевины) - полидисульфиды мочевины и тиомочевины, конкурирующие с субстратом за связывание с активными центрами уреазы, и амиды тиофосфорной кислоты - аналоги замещенных фосфородиамидатов, обнаруживших максимальную ингибирующую эффективность уреазы [9-11, 15]. Однако не все из изученных ингибиторов нетоксичны, что может стать препятствием при их использовании в качестве лекарственных средств.
Цель работы - систематическое кинетическое исследование ингибирования уреазы соевых бобов органическими нетоксичными хелатирующи-ми агентами - циклическими Р-трикетонами 1-Х1, неорганическим лигандом никеля - фторид-ио-
ном при разных рН среды и аналогом субстрата -гидроксимочевиной.
МЕТОДИКА
Реагенты. В работе использовали уреазу соевых бобов производства "Биолар" (Олайне, Латвия) с исходной активностью 1032 ед. Самнера на 1 г и мочевину марки о. с. ч. как субстрат, а также фторид натрия марки ч. д. а., ЭДТА и диметил-формамид производства "Реахим" (Россия). Концентрацию уреазы рассчитывали по коэффициенту
поглощения фермента А}%м см (280 нм) = 6.2 [20]. Все рН-индикаторы производства "Реахим" (Россия), указанные в табл. 2, использовали при разных исходных значениях рН реакционных смесей, а приготовление растворов рН-индикаторов проводили, как описано в монографии [21]. ДМФ перед употреблением перегоняли.
Ингибиторы уреазы. Циклические Р-трикето-ны (ЦТК) I и II (табл. 1) синтезировали по известным методикам, описанным в работах [22, 23], ЦТК - III, У,У1, X и XI - по [24]; соединения IV, VII, VIII и IX - по [25-28] соответственно. ЦТК, I-VII, X, XI и соединение IX были охарактеризованы общепринятыми методами.
В качестве примера приведем характеристики ЦТК V: т. пл. 101-102°С; спектр 1Н-ЯМР (СДС13, ТМС), 5, м. д. - 2.15-2.50 м (2Н, СН2), 2.50-2.90 м (2Н, СН2), 3.05 с (3Н, СН3СО), 3.45 д. д. (1Н, СН, ^ = 10 гц, 12 = 5 гц), 3.82 с (3Н, СН3О), 18.40 с (1Н, Он, енол); ИК-спектр (в таблетке с КБг), V, см-1 -1735, 1650, 1600, 1560; масс-спектр, т/е: М+ 212.
Гидроксимочевина синтезирована по методике [29] и любезно предоставлена нам Н.А. Филь-ченковым (Институт биоорганической химии НАН Белоруси, г. Минск).
Определение каталитической активности уреазы в присутствии циклических Р-трикетонов 1-Х1 и гидроксимочевины. Для решения поставленных в работе задач необходимо измерять скорость гидролиза мочевины при низких концентрациях уреазы в условиях подавления ее активности потенциальными ингибиторами. Необходимую в таких случаях точность определения начальных скоростей уреолиза может обеспечить только спектро-фотометрический контроль активности уреазы с использованием рН-индикаторов, предложенный в работе [3] и успешно использованный нами ранее [6-8, 11].
Приготовление субстратных смесей. К 100 мл
водного раствора мочевины (0.03 М) добавляли ЭДТА до конечной концентрации 0.05 мМ для связывания примесных ионов тяжелых металлов. В соответствии с [21], рН-индикатор (крезоловый красный) растворяли в смеси 0.2 мл 0.05 М КаОН и 0.3 мл Н2О. Раствор красителя добавляли к рас-
твору мочевины и доводили смесь до необходимого начального рН 7.4, используя 0.05 М NaOH или HCl.
Уреолиз мочевины в присутствии ингибитора (In) и без него проводили при 36°С. Общий объем смеси составлял 0.8 мл. К 0.69 мл исходного раствора субстратной смеси добавляли 0.1 мл раствора уреазы в воде, рН которой доводили до 7.4 под-щелачиванием, и 0.01 мл раствора ингибитора в ДМФ или в этаноле (см. табл. 1). Конечная концентрация уреазы составляла 8.0 нМ, мочевины 0.255-0.259 мМ, а концентрации ингибитора изменялись в пределах 10-300 мкМ. В ходе уреолиза без ингибитора и в его присутствии следили за изменением оптической плотности рН-индикатора (крезолового красного) и строили кинетические кривые в координатах: оптическая плотность-время. Измерения проводили на спектрофотометре Specol-211 ("Карл Цейсс", Германия). Отсчет нулевой оптической плотности проводили по поглощению света субстратной смесью без ингибитора. Скорость ферментативной реакции, v0, выражали в условных единицах изменения оптической плотности при 578 нм в 1 сек (отн. ед.) и принимали ее за 100% в отсутствие ингибитора.
Определение каталитической активности уреазы в присутствии фторид-ионов. Субстратные смеси, содержавшие мочевину (0.03 М), ЭДТА (0.05 мМ) и рН-индикатор, соответствующий заданной величине рН (см. табл. 2), готовили точно так же, как описано выше. Уреолиз мочевины в присутствии фторида натрия и без него проводили при 20°С. Готовили исходные растворы NaF с концентрациями от 10-5 до 10-1 М; 0.8 мл раствора NaF добавляли к 7.2 мл субстратной смеси. Общий объем реакционной смеси составлял 8 мл: конечные концентрации равнялись 0.027 М мочевины и 1.0-10 000 мкМ NaF. Из смеси отбирали аликвоту объемом 0.79 мл и начинали реакцию добавлением к ней 0.01 мл раствора уреазы, оптимальные концентрации которой были подобраны для каждого из рН-индикаторов и приведены в табл. 2.
За реакцией следили спектрофотометрически, регистрируя оптическую плотность смеси при длинах волн, соответствующих максимуму поглощения конкретного рН-индикатора (табл. 2). Скорость реакции, v0, определяли, как описано выше, и выражали в отн. ед.
Специальными опытами было проверено влияние фторид-иона на рН растворов субстрата с бромкрезоловым пурпурным (рН 4.95) и крезоло-вым красным (рН 6.45) (рис. 1а) и влияние фторида на оптическую плотность субстратной смеси мочевины и бромкрезолового пурпурного (рис. 16). Показано, что в интервале концентраций 1.0500 мкМ NaF не влиял на рН и оптическую плотность раствора мочевины с красителем, и только
Таблица 1. Структурные формулы циклических Р-трикетонов и кинетические параметры их ингибирующего действия на уреолиз мочевины при 36°С в водном растворе, рН 7.4: КМ = 47.6 мМ, уреаза, 8.0 нМ
№ Структурная формула Молекулярная масса [Ь]*, мкМ К, мкМ Органический сорастворитель
О О и N
I Г'У^СИз ^О ОО II II 141 90 58.4 ДМФ
II /Ч^СИз СИ3^О^О ОО N N 168 110 71.4 ДМФ
III (СИ2) 10СИ3 СИ3О-С=О ОО II II 356 135 88.0 Этанол
IV Г^^СИз 00 1 1 142 175 113.6 ДМФ
V СИзО-С=О ОО II II 212 190 123.0 ДМФ
VI ИзС>Ои ОО 11 11 244 200 130.0 ДМФ
VII ЛЛсИ3 140 210 136.0 ДМФ
О
ОО N и
VIII |^ЧГкСИ3 158 290 188.0 ДМФ
Таблица 1. Окончание
№ Структурная формула Молекулярная масса [1п]*, мкМ К, мкМ Органический сорастворитель
ОН 1 О II
IX 6 Л (СН2)10СН3 292 300 195.0 ДМФ
ОН
О || О II
X НзС Л НзС А О и ^%СН2)мСНз О II 378 320 208.0 Этанол
XI НзС Л Н3С СНзО- А -С= ^%СН2)1бСНз О 464 1300 847.0 Этанол
Таблица 2. Условия реакции и кинетические параметры ингибирования гидролиза
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.