БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2011, том 28, № 1, с. 68-76
УДК 547.466:542.978:547.458
ИНГИБИТОР ВОСПАЛЕНИЯ, ПЕПТИДНЫЙ ФРАГМЕНТ (65-76) МОНОЦИТАРНОГО ХЕМОТАКСИЧЕСКОГО БЕЛКА-1 (МСР-1), ПРЕПЯТСТВУЕТ СВЯЗЫВАНИЮ МСР-1 С ГЕПАРИНОМ
© 2011 г. Т. Л. Красникова1*, П. И. Никитин2, Т. И. Ксеневич2, Б. Г. Горшков2, Т. Л. Бушуева1, Т. И. Арефьева1, Н. Ю. Рулева1, М. В. Сидорова1, А. А. Азьмуко1, Ж. Д. Беспалова1
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российского кардиологического научно-производственного комплекса Министерства здравоохранения и социального развития РФ, 3-я Черепковская 15а;
121552 Москва; факс: 8 495 414 69 56; *электронная почта: krasnikova@cardio.ru, tlkrasnikova@gmail.com 2Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, ул. Вавилова, 38, 119991 Москва
Поступила в редакцию 08.06.2010 г.
Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) ССЬ2 является одним из важнейших хемоки-нов, участвующих в воспалении. МСР-1 стимулирует миграцию моноцитов и некоторых популяций лимфоцитов в зону поражения, в частности в места формирования атеросклеротических бляшек. Разработка препаратов ингибиторов МСР-1 представляется актуальной в настоящее время. Ранее мы получили додекапептид (65—76) С-концевого домена МСР-1 (пептид Х), обладающий противовоспалительным действием. Механизм действия хемокинов, в том числе и МСР-1, связан с активацией рецептора ССИ2 и взаимодействием с гликозаминогликанами (ГАГ) поверхности клеток и внеклеточного матрикса. Пептид Х не влияет на взаимодействие МСР-1 с ССИ2. Мы предположили, что противовоспалительное действие пептида Х обусловлено ингибированием связывания МСР-1 с ГАГ. С этой целью с помощью безмаркерного биосенсорного прибора Пикоскоп®, твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и методом собственной флуоресценции изучали влияние пептида Х на взаимодействие МСР-1 с гепарином. Согласно полученным данным, пептид Х препятствует связыванию МСР-1 с гепарином, что, вероятно, обусловлено взаимодействием одних и тех же участков МСР-1 и с гепарином, и с пептидом. Возможно, это обстоятельство определяет противовоспалительное действие пептида Х.
Ключевые слова: моноцитарный хемотаксический белок-1, воспаление, пептид.
Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) ССЬ2 — один из важнейших хемокинов, участвующих в воспалении. Стимулируя миграцию моноцитов и некоторых популяций лимфоцитов, хемокин МСР-1 играет существенную роль в атерогенезе, в развитии ревматоидного и подагрического артритов, при астме, нефрологи-ческих и онкологических заболеваниях [1—3]. Разработка препаратов ингибиторов хемокинов, в частности МСР-1, является в настоящее время актуальной задачей. В число соединений, претендующих на роль таких препаратов, входят пептидные фрагменты МСР-1 [4], мутантные формы МСР-1 [5] и ингибирующие антитела [6].
Молекула хемокина МСР-1 содержит 76 аминокислотных остатков с двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Суз11-Суз36 и Суз12-Суз52). Пространственная (третичная) структура МСР-1, как и всех представителей семейства СС хемокинов, состоит из подвижного М-концевого участка, жесткой средней части из трех антипараллельных р-слоев и С-концевой
а-спирали [7]. N-концевой фрагмент МСР-1 участвует во взаимодействии МСР-1 с G-белок-сопряженными рецепторами CCR2 моноцитов и CCR4 Т-клеток [8].
Помимо связывания рецептора для миграционной активности хемокинов in vivo в условиях крово- и лимфотока необходимо создание концентрационного градиента хемокинов за счет их взаимодействия с гликозаминогликанами (ГАГ) гепарином/гепарансульфатом на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса [9— 11]. Большинство хемокинов — основные белки, взаимодействующие с полианионными группами ГАГ. Участки связывания МСР-1 с ГАГ локализуются в а-спирали С-концевого домена МСР-1, при этом абсолютно необходимы, по-видимому, остатки Lys58 и His66 [12, 13]. Мутации по этим участкам приводят к неспособности МСР-1 взаимодействовать с гепарином и вызывать хемотаксис клеток in vivo.
Ряд исследователей полагают, что взаимодействие с ГАГ сопровождается олигомеризацией хе-
мокинов [9], как это установлено, в частности, для МСР-1 [5]. В растворе при концентрации выше 2 нМ МСР-1 образует димеры посредством взаимодействия аминокислот N-концевого домена [14]. Показано, что неспособная к димериза-ции мутантная форма МСР-1 может связываться с рецептором и активировать внутриклеточные сигнальные каскады in vitro, однако при введении животным она не вызывает миграции лейкоцитов [5, 9, 15]. По всей видимости, олигомеризация МСР-1 in vivo тесно связана с взаимодействием МСР-1 с ГАГ на поверхности клеток: связывание с ГАГ способствует образованию и стабилизации олигомеров (димеров, а также тетра-, окта- и др.) и концентрированию молекул хемокина у клеточной поверхности.
Ранее мы проанализировали структуру МСР-1 с помощью пакета компьютерных программ, применяемых для выявления антигенных детерминант белков. На основании этих расчетов отобрано и синтезировано несколько пептидов, среди которых оказался фрагмент (65—76) С-кон-цевого домена МСР-1 (DHLDKQTQTPKT, пептид Х) [16, 17]. Пептид Х ингибировал опосредованную МСР-1 миграцию промоноцитарных клеток ТНР-1 и моноцитов крови человека in vitro и препятствовал миграции лейкоцитов в участки воспаления у различных животных [17]. Для выяснения механизма действия пептида Х мы изучали его влияние на связывание МСР-1 с рецептором CCR2 [18]. Известно, что взаимодействие хемокинов с рецепторами сопровождается быстрой реорганизацией цитоскелета и активацией молекул адгезии [19], в частности, под действием МСР-1 значительно возрастает экспозиция р2-инте-гринов (CD11b/CD18) моноцитами и гранулоци-тами крови [20]. Мы не обнаружили влияния пептида X на МСР-1-стимулированную экспозицию интегринов CD11b/CD18 моноцитами периферической крови человека, т.е. фрагмент С-конце-вого домена МСР-1 не ингибировал связывание МСР-1 с рецептором CCR2 [18]. Пептид Х содержит остатки трех основных аминокислот: гисти-дина (66), лизина (69) и лизина (75) из а-спирали С-концевого домена МСР-1, поэтому мы предположили, что его противовоспалительный эффект может быть обусловлен блокадой связывания МСР-1 с гепарином и, как следствие, с подавлением олигомеризации МСР-1.
Цель настоящей работы состояла в изучении влияния пептида Х на состояние МСР-1 в растворе с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и иммуноблотинга, и в анализе взаимодействия МСР-1 с гепарином и пептидом Х методами определения изменений оптической толщины слоя белка с помощью биосенсора — Пикоскопа®, ИФА и собственной флуоресценции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез пептида Х выполняли автоматическим твердофазным методом с использованием Fmoc-технологии. В исследовании использовали ре-комбинантный МСР-1 с 0.15% БСА в качестве карьерного белка (R&D Systems, США). Для электрофореза использовали рекомбинантный МСР-1 без альбумина той же фирмы. Реактивы: гепарин, конъюгат стрептавидин-пе-роксидаза, стрептавидин, апротинин и реактивы для ПААГ-электрофореза в присутствии доде-цилсульфата Na (SDS, Sigma, США). Монокло-нальные антитела (мАТ) мыши к МСР-1 человека, клон 5D3-F7, биотинилированные кроличьи поликлональные антитела к МСР-1 человека (BD Pharmingen, США), конъюгат поликлональных антител кролика к иммуноглобулинам мыши с пероксидазой хрена (ИМТЕК, Россия). Гепарин биотинилировали, присоединяя к нему биоти-нил-б-аминокапроновую кислоту с использованием карбодиимида. Биотинилирование подтверждали с помощью 1Н-ЯМР-спектрометрии.
Анализ влияния пептида Х на димеризацию МСР-1 в растворе с помощью гель-электрофореза и Вестерн-блотинга. Прежде всего мы попытались использовать электрофорез в неденатуриру-ющих условиях (нативный электрофорез), как наиболее адекватный метод оценки состояния белка в растворе. Однако столкнулись при этом с трудно решаемыми проблемами: наши попытки подобрать состав буферов и условия проведения электрофореза, к сожалению, не увенчались успехом. Схожие проблемы были, по-видимому, и у других исследователей, так как нам не удалось найти ни одной ссылки на нативный электрофорез МСР-1 (и других катионных хемокинов). Возможно, это обусловлено положительным зарядом МСР-1 (pI 9.7) и его малой молекулярной массой (8.7 кДа). В связи с этим для изучения димериза-ции МСР-1 мы использовали электрофорез в SDS-ПААГ с предшествующим поперечными сшивками изучаемого белка и белка + пептид с помощью дисукцинимидного эфира субериновой кислоты (ДСС), как описано ранее [14]. Для экспериментов брали раствор рекомбинантного МСР-1 в полном фосфатном буфере (ФБ) с концентрацией 5 и 0.6 мкМ. Рабочая концентрация ДСС (2 мМ) и условия проведения сшивки, как описано в [14]. Пептид Х добавляли к раствору МСР-1 в конечной концентрации 100 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С, затем пробы подвергали электрофорезу в 15% ПААГ в присутствии SDS. Гель окрашивали серебром либо использовали электроперенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны инкубировали последовательно с био-тинилированными антителами кролика к МСР-1 человека и конъюгатом стрептавидин-перокси-даза. Белковые полосы выявляли с помощью хе-
милюминесцентных методов (набор ECL, Amer-sham). Контролем служил апротинин (5 мкМ в полном ФБ), близкий по молекулярной массе к МСР-1.
Анализ взаимодействия МСР-1 с гепарином с помощью безмаркерного биосенсорного прибора Пикоскоп®. Биосенсор Пикоскоп® был разработан и создан в лаборатории биофотоники Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН. Прибор был успешно испытан для регистрации динамики взаимодействия различных белковых молекул [21, 22]. Пикоскоп® позволяет интерференционным методом количественно регистрировать изменение оптической толщины молекулярного слоя наносимых соединений (произведение показателя преломления n и геометрической толщины слоя Ad) на поверхности с разрешением по глубине в пикометровом диапазоне толщины. Измеряемую толщину усредняют по области наблюдения, т.е. на приборе можно детектировать "островковую" сорбцию в 103 раз меньшего количества молекул, чем необходимо для формировани
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.