ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 46-52
УДК 661.734.1:577.15:663.15
ИНГИБИТОРЫ АМИЛАЗ ИЗ Streptomyces lucensis ВКПМ А^1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ А^1734 © 2015 г. Н. Ю. Шарова
Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок, г. Санкт-Петербург, 191014 e-mail: vniipakk55@mail.ru Поступила в редакцию 12.05.2014 г.
Исследовано действие ингибиторов, синтезируемых штаммами Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 и Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743, на амилазы различного происхождения. Выявлены различия в действии ингибиторов на грибные амилазы, панкреатическую амилазу и амилазу из крови человека. Установлено, что изучаемые ингибиторы — вещества псевдоолигосахаридной природы, проявляли активность и стабильность в широких интервалах рН и температуры. Проведено сравнение физико-химических и биохимических свойств выделенных ингибиторов с известными микробными ингибиторами а-глюкозидаз.
DOI: 10.7868/S0555109915010158
В результате деструкции полисахаридов образуются простые сахара, непосредственно вовлекаемые клетками различных организмов в более сложные биохимические превращения. Избыточное содержание таких сахаров приводит к нарушению углеводного баланса. При этом у людей может возникнуть сахарный диабет и сопутствующие осложнения, такие, как гипергликемия, гиперлипидемия. Для их предотвращения практикуют введение в пищевой рацион сахарозаме-нителей и подсластителей, физическую нагрузку в сочетании с диетой, что требует тщательного подхода к конкретному индивидууму [1—3]. Альтернативным подходом к решению подобного рода проблем является гликомодуляция — включение в рацион добавок или лекарственных средств на основе ингибиторов глюкозидаз. Эти вещества тормозят или угнетают активность ферментов пищеварительного тракта, непосредственно участвующих в гидролитическом расщеплении углеводов. Действие ингибиторов приводит к замедлению всасывания сахаров и снижению содержания глюкозы в крови. Наибольший интерес представляют микробные метаболиты. По сравнению с ингибиторами животного и растительного происхождения они обладают более широкой специфичностью и спектром действия [4, 5]. Выделенные ингибиторы микробного происхождения можно условно разделить на вещества полипептидной и псевдосахаридной природы. Особый интерес в научном и практическом плане вызывает вторая группа веществ, представители которой характеризуются многообразием структурных форм, широким спектром действия, устойчивостью к изменению рН и температуры [2, 6]. Наиболее де-
тально исследована и имеет практическое применение акарбоза, синтезируемая Actinoplanes sp. [6]. Акарбоза — псевдотетрасахарид, который снижает абсорбцию крахмала, декстринов, мальтозы и сахарозы. На ее основе фирмой "Bayer" (Германия) создан препарат глюкобай. Для профилактики различных нарушений углеводного обмена, регуляции уровня сахара в крови и диетотерапии рекомендованы миглитол, эмиглитат, воглибоза [7—9]. Эти препараты угнетают активность а-глюкозидаз, которые катализируют гидролиз олиго-и дисахаридов. На первой стадии расщепления полисахаридов основным ферментом является а-амилаза. Среди эффективных ингибиторов амилаз известны в основном вещества белковой природы [10].
В результате скрининга штаммов рода Streptomyces из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института пищевых добавок и их селекции выделены два продуцента ингибиторов амилаз.
Цель работы — изучение свойств ингибиторов, синтезируемых новыми штаммами стрепто-мицетов.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили ингибиторы амилаз, синтезируемые Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 (Шарова Н.Ю., Ходкевич О.А., Позднякова ТА.) и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 (Шарова Н.Ю., Никифорова Т.А., Позднякова Т.А.).
Посевной мицелий выращивали на среде, следующего состава, (г/л): соевая мука — 10.0; глюкоза — 10.0; натрий хлористый — 5.0; кальций угле-
ИНГИБИТОРЫ АМИЛАЗ ИЗ Streptomyces lucensis ВКПМ АС-1743
47
кислый — 1.0; рН среды 7.0. Инокулят или посевной материал вносили в ферментационную среду, содержащую следующие компоненты (г/л): кукурузный крахмал — 20; соевая мука — 5.0; натрий хлористый — 3.0; калий фосфорнокислый одноза-мещенный — 1.0; магний сернокислый семивод-ный — 0.5, рН среды 7.0. Культуры выращивали в качалочных колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды при 28°C, скорость перемешивания 200 об/мин, [11, 12]. Время выращивания 96 ч [11, 12].
После окончания срока биомассу удаляли микрофильтрацией через фильтрующий элемент патронного типа ("Sartorius", Германия) с мембраной из полиэфирсульфона ("Sartobran P" Германия) под давлением 0.2 МПа и температуре 25°C. Использовали мембрану с размером пор 300 мкм, затем для удаления оставшихся клеток продуцента использовали мембрану с размером пор 0.45/0.20 мкм.
После микрофильтрации полученный раствор очищали ультрафильтрацией в проточном режиме через полые волокна из полисульфона, задерживающие вещества с молекулярной массой (ММ) 15 кДа, под давлением 0.2 МПа и температуре 25°C. Колонка ("Биотест", Россия) (dxh = 5 х х 25 см) имела площадь фильтрующей поверхности волокон 0.2 м2. Скорость пропускания раствора составляла 50 мл/мин. Полученный очищенный раствор осветляли активированным углем при +70°C из расчета 2 г угля на 100 г концентрата в течение 1 ч при периодическом перемешивании. Осветленный концентрат высушивали при температуре +50°C [13].
Очистку ингибиторов проводили методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-25 (2.2 х х 65 см) ("Pharmacia", Швеция), используя в качестве элюента дистиллированную воду при скорости элюции 6 мл/ч с • м2, для подтверждения чистоты проводили повторную хроматографию в тех же условиях.
Лиофилизацию фракций ингибитора проводили в низкотемпературном шкафу TV-2000 в ампулах объемом 2 мл при высоте слоя раствора 12 мм. Температура замораживания составляла —50°C, длительность 20 ч, положение ампул вертикальное. Препараты высушивали на установке ТГ-50 ("Hochvakuumtechnik", Германия) при скорости нагрева полок 20°C^.
Цветность растворов оценивали по показателю оптической плотности при длине волны 360 нм (D360) на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", Россия) в кювете толщиной 1 см.
Содержание белка определяли методом Лоури.
Для изучения компонентного состава ингибиторов проводили кислотный гидролиз 2 н. раствором серной кислоты при 100°C в течение 15, 30, 45, 60 мин и 6 ч в запаянных стеклянных ампулах с проведением последующей ТСХ и количествен-
ным определением углеводов и редуцирующих сахаров антроновым методом и методом Шомо-ди—Нельсона [14].
ТСХ проводили на пластинах "Sorbfil" марки ПТСХ-П-В размером 10 х 10 см с силикагелем типа СТХ-1ВЭ с зернением 8—12 мкм на полимерной подложке ("ИМИД", Россия) в системе растворителей н-бутанол—уксусная кислота—вода (3 : 1 : 2) с детектированием специфическими реактивами на различные группы сахаров [14].
ИК-спектры ингибиторов определяли на "Specord 75 R" (Германия) в режиме пропускания: разрешение — 4.000, усиление — 8.0, скорость зеркала — 0.6329; диафрагма — 100.00; детектор — DTGS KBr, светоделитель — KBr.
ММ ингибитора определяли методом гель-фильтрации на сефадексе G-25 ("Pharmacia", Щве-ция, колонка 2.2 х 65 см) с использованием в качестве маркеров N-a-бензоил-аргинина (ММ. 439.95; "Sigma-Aldrich" GmbH, Германия), по-русски НАДФ-Na (ММ765.4; "Sigma-Aldrich" GmbH, Германия), витамина В12 (ММ1579.6; ОАО "Веро-фарм", Россия), полиэтиленоксида (ММ 2000; ООО "РусХимтрейд", Россия) и в качестве элюента — дистиллированной воды; скорость элюции составила 6 мл/ч см2.
Для определения рН-стабильности 0.1%-ный раствор ингибитора в 0.1 М универсальном буферном растворе (рН 2—12) термостатировали в течение 3 ч при температуре (25 ± 1)°C, затем определяли ингибиторную активность.
Температурную стабильность изучали, выдерживая 0.1%-ный раствор ингибитора в дистиллированной воде в интервале температур от +25°C до +200°C не менее 3 ч и затем также определяли ингибиторную активность.
Температуру плавления определяли на приборе KSP1D ("Kruess", Германия).
Сродство ингибиторов к органическим растворителям (х. ч.) оценивали, растворяя лиофи-лизированные препараты в безводном метаноле ("Tianjin Ruifengtiantai Internationa Trade", Китай), 96%-ном этаноле (ООО "РОСБИО", Россия), диметилсульфоксиде (ДМСО, "Компонент-Реактив", Россия), ацетоне, н-бутаноле и хлороформе ("Компонент-Реактив", Россия), перемешивали в течение 10 мин и определяли ин-гибиторную активность.
Ингибиторную активность определяли по отношению к свиной панкреатической a-амилазе (КФ 3.2.1.1; 1,4-а^-глюкан глюкангидролаза). В опытах использовали панкреатин ("Sigma-Ald-rich", США; 4х^Р specifications). Раствор фермента и препараты ингибиторов разводили 0.01 М фосфатным буферным раствором, рН 7.0. Разведенные растворы вносили по 0.5 мл в пробирки, добавляли 0.5 мл раствора панкреатина (2 мг/мл),
быстро перемешивали и выдерживали при температуре 37°С в течение 10 мин. Затем в пробирки прибавляли по 2 мл 1%-ного растворимого крахмала (в 0.1 М фосфатном буферном растворе), перемешивали и выдерживали при температуре 37°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали внесением 3.0 мл 0.1 М раствора соляной кислоты. Затем из пробирок отбирали по 0.2 мл реакционной смеси, переносили в другие пробирки, добавляли по 9.8 мл 0.01 М водного раствора йода и перемешивали. Растворы в пробирках приобретали фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала. Непосредственно после смешивания растворов измеряли значение оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", Россия) при длине волны 660 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения дистиллированную воду. Аналогичным образом проводили контрольные реакции, используя дистиллированную воду вместо раствора ингибитора и раствора панкреатина — контроль 1, вместо раствора ингибитора — контроль 2. В итоге контрольная проба 1 приобретала синий цвет, контрольная проба 2 — бледно-фиолетовый цвет.
За единицу ингибиторной активности принимали такое количество инги
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.