ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 615.357.03:617-001.36].015.4.076.9
ИНГИБИТОРЫ КАЛЬМОДУЛИНА ПОДАВЛЯЮТ КАЛЬЦИЕВЫЙ СИГНАЛ ОТ РЕЦЕПТОРОВ СЕРОТОНИНА В ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ И УСТРАНЯЮТ ВАЗОКОНСТРИКТОРНЫЙ ОТВЕТ НА ВНУТРИВЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ СЕРОТОНИНА
© 2013 г. Л. М. Кожевникова*, И. Л. Жарких*, П. В. Авдонин***
*НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: lubovmih@yandex.ru Поступила в редакцию 22.10.2012 г.
Проведено сравнительное исследование действия ингибиторов кальмодулина трифлуоперазина, W-12 и W-13 и блокатора каналов TRPV1 капсазепина на рецепторзависимый обмен кальция в глад-комышечных клетках аорты крысы и на сократимость изолированной аорты. Установлено, что три-флуоперазин практически полностью устраняет прирост концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток, выделенных из аорты крысы, и гладкомышечных клеток линии A7r5 в ответ на действие серотонина и не влияет на реакцию клеток на вазопрессин и ангиотензин II. W-12 и W-13 также не уменьшают индуцированный вазопрессином и ангиотензином II прирост концентрации ионов кальция, но вдвое снижают его подъем в ответ на воздействие серотонина. Обнаружено, что эффективность подавления кальциевого обмена ингибиторами кальмодулина коррелирует с выраженностью угнетения ими сократительного ответа аорты на действие серотонина. Выявлено, что ингибирующее воздействие блокаторов кальмодулина на кальциевый обмен в гладкомышечных клетках и сократимость изолированной аорты крысы при активации вазоконстрикторных рецепторов серотонина реализуется по TRPV1-независимому механизму. В экспериментах in vivo показано, что трифлуоперазин не влияет на гипотензивную реакцию у крыс, наблюдаемую в норме в ответ на внутривенное введение серотонина, но устраняет гипертензивный эффект этого нейротрансмитте-ра у крыс после хронического введения дексаметазона. Полученные результаты подтверждают ранее высказанную нами гипотезу о непосредственном участии кальмодулина в передаче сигнала от вазоконстрикторных рецепторов серотонина.
DOI: 10.7868/S0002332913040085
Ранее нами было показано, что различные по химическому строению ингибиторы кальмодулина (СаМ) трифлуоперазин (TFP) и N-(4-aminobu-tyl)- 5-chloro-2-naphthalenesulfonamide hydrochlo-ride (W-13) избирательно подавляют вазокон-стрикцию изолированных фрагментов аорты и брыжеечной артерии крыса в ответ на воздействие серотонина (5НТ) и норадреналина (NA) (Кожевникова, Авдонин, 2012). Подавление 5НТ-индуцированной вазоконстрикции TFP и W-13 было обусловлено блокированием сигнала от 5НТ1А- и 5НТ2А-рецепторов. Ингибиторы СаМ не влияли на передачу сигнала от 5НТ1В- и 5НТ2В-рецепторов, ответственных за реализацию вазодилататорного эффекта 5НТ. Обнаруженное в наших исследованиях незначительное снижение сократительной реакции аорты крысы на воздействие NA и 5НТ под влиянием ингибитора СаМ-зависимой протеинкиназы II (CaMKII) KN93 позволило предположить, что мишенью TFP и W-13 является СаМ, взаимодействующий непосредственно с молекулами
5НТ1А-, 5НТ2А- и а-адренорецепторов (a-AR). В пользу этого предположения свидетельствовали и данные о том, что ингибиторы СаМ TFP и W-13 не влияли на передачу сигнала на уровне зависимых от G-белков пострецепторных звеньев и существенно не снижали силу сокращения изолированных колец аорты в ответ на воздействие активатора потенциалуправляемых Са2+-каналов 30 мМ KCl (Кожевникова, Авдонин, 2012). Сравнительно недавно были идентифицированы участки связывания СаМ с внутриклеточными фрагментами 5НТ-рецепторов, a-AR, мускари-новых, опиатных, допаминовых, метаботропных глутаматных рецепторов, а также рецепторов эпи-дермального фактора роста и гликопротеина VI (Minakami et al., 1997; Nakajima, 1999; Bofill-Car-dona et al., 2000; Belcheva et al., 2001; Gardiner et al., 2005; Turner, Raymond, 2005; Raymond et al., 2006; Labasque et al., 2008; Sánchez-González et al., 2010). Функциональная значимость прямого взаимодействия СаМ с молекулами рецепторов пока не изучена.
СаМ является основным сенсорным белком для ионов Са (Zhang, Yuan, 1998; Bal et al., 2008). Участие Са2+/СаМ в регуляции многочисленных сигнальных каскадов осуществляется на уровне активации не только ключевых ферментов и факторов транскрипции, но и ионных каналов плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума (Tebar et al., 2002; Vetter, Leclerc, 2003; Bal et al., 2008, 2010). Са2+/СаМ в большинстве случаев ингибирует различные Са2+-каналы и защищает таким образом клетку от цитотоксиче-ского действия высокой концентрации ионов Са. Сравнительно недавно было установлено, что в регуляции функции сердечно-сосудистой системы как в норме, так и при патологии большую роль играют каналы transient receptor potential va-nilloid 1 (TRPV1). Однако механизмы, посредством которых TRPV1-каналы модулируют сократимость сосудов и миокарда, не очевидны (Inoue et al, 2006; Earley, 2010; Ohanyan et al, 2011; Ven-^к^шра, 2011). Эти каналы экспрессируются в сердечной мышце, гладкомышечных и эндотели-альных клетках сосудов, вазосенсорных нейронах (Yang et al., 2006; Watanabe et al., 2008; Baylie et al., 2011; Moccia et al., 2012). Показано, что в C- и N-терминальных регионах TRPV1-каналов имеются СаМ-связывающие участки (Devesa etal., 2011; Nilius, Owsianik, 2011; Ho et al., 2012). Ингибиторы СаМ кальмидазол, TFP и в меньшей степени W-7 и W-13 могут непосредственно взаимодействовать с TRPV1-каналами предположительно в зоне их связывания с СаМ и подавлять их активность (Olah et al., 2007). C учетом этих данных нам представлялось важным выяснить, является ли избирательное подавление ингибиторами СаМ сигнала от вазоконстрикторных рецепторов 5НТ и NA результатом селективного блокирования СаМ или обусловлено их взаимодействием с TRPV1-каналами и последующим снижением концентрации ионов Са в цитоплазме клеток ([Ca2+^m). С этой целью в модельных экспериментах на культуре гладкомышечных клеток и изолированных сосудах изучено влияние ингибиторов СаМ и TRPV1-каналов на агонистиндуци-рованный внутриклеточный обмен Са2+ и сократимость сосудов. В экспериментах in vivo проведена оценка возможности подавления активности вазоконстрикторных 5НТ-рецепторов с помощью ингибиторов СаМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на культуре гладкомышеч-ных клеток (ГМК), выделенных нами из аорты крысы, и на ГМК линии A7r5. ГМК выделяли из брюшной части аорты крыс-самцов породы Wis-tar (150—200 г) ферментативным методом по ранее описанной методике (Кожевникова и др., 2011). Культура клеток линии A7r5 была получена
из ATCC (США). Культивирование проводили на питательной среде DMEM (ПИПВЭ РАМН), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS). Среда содержала 4.5 г/л глюкозы, 1.5 г/л NaHCO3, 4 мМ L-глюта-мин. Снятие клеток проводили раствором 0.25%-ного трипсина и 0.02%-ной этилендиаминтетра-уксусной кислоты (ЭДТА) в изотоническом солевом растворе (Sigma, США). Для экспериментов по определению [Са2+]цит клетки высаживали на 96-луночный планшет в расчете 25 000 кл./лунку и культивировали в течение 5—7 сут.
Изменения [Са2+]цит в клетках регистрировали с помощью флуоресцентного зонда Fura 2-АМ (Sigma) на микропланшетном флуоресцентном ридере Synergy 4 (BioTec, США). Загрузку клеток Fura 2-AM (1 мкМ) проводили в течение 60 мин при температуре 25—30°С в физиологическом солевом растворе (PSS), содержавшем 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2, 10 мМ глюкозу, 5 мМ Hepes (pH 7.2). Флуоресценцию клеток регистрировали при длинах волн возбуждения 340 и 380 нм и при длине волны излучения 505 нм. Изменения [Ca2+^m на графиках отображены в виде отношения флуоресценции при длинах волн 340 и 380 нм (F340/F380). Для оценки максимального значения F340/F380 к клеткам в конце измерения добавляли 10 мкМ дигитонин (Sigma).
Были использованы различные по химическому строению ингибиторы СаМ — N-(4-aminobu-tyl)-2-naphthalenesulfonamide hydrochloride (W-12) и его хлорсодержащий аналог W-13 (Alexis, США) и TFP (Sigma). ГМК инкубировали в течение 3 мин с ингибиторами СаМ TFP, W-12 и W-13 в концентрациях соответственно 10-5, 10-3 и 10-4 М и регистрировали изменение [Ca2+]^ в ответ на добавление к клеткам 5НТ (10-5 М), ангиотензина II (ATII, 10-7 М) и аргинин-вазопрессина (AVP, 10-7 М) (Sigma). В экспериментах на культуре ГМК линии А7г5 изучено влияние блокатора TRPV1-ra-налов капсазепина (CZP, Tocris, США) на кальциевый сигнал, вызванный активацией 5НТ- и вазо-прессиновых рецепторов. Время инкубации клеток линии А7г5 с CZP (40 мкМ) составляло 3 мин. Кроме того, оценивали характер изменения [Ca2+^m при воздействии на клетки А7г5 аго-ниста TRPV1-каналов капсаицина в концентрациях 2 и 10 мкМ (CAP, Tocris). В контрольных экспериментах к клеткам А7г5 добавляли PSS с соответствующей концентрацией растворителя CZP диметилсульфоксида (DMSO).
В экспериментах на изолированных фрагментах аорты крысы оценивали влияние ингибиторов TRPV1-каналов на сократимость сосудов. Опыты проводили на крысах-самцах породы Wistar массой 200—250 г. В качестве наркоза использовали 25%-ный раствор уретана (4 мл/кг). Крыс декапетировали, извлекали грудной отдел
аорты, который помещали в охлажденный физиологический раствор Кребса—Хенселейта. Сосуды очищали от жировой и соединительной тканей и нарезали на кольца шириной 1.5—2 мм, которые крепили на держателях, помещенных в раствор Кребса—Хенселейта (37°С), аэрируемый карбогеном (смесь О2 : СО2 = 95% : 5%). Силу сокращения изолированных фрагментов аорты измеряли в изометрическом режиме. Изолированные фрагменты аорты крысы предварительно инкубировали в течение 20 мин с ингибитором TRPV1-каналов CZP (20 и 40 мкМ), после чего оценивали сократительную реакцию в ответ на воздействие NA (10-7 М), 5HT (10-5 М), AVP (10-8 М) и ATII (10-8 М). Контролем служили опыты, в которых оценивались сократительные свойства сосудов после их инкубации с ингибиторами СаМ TFP (20 мкМ) или W-13 (50 мкМ).
Как было показано ранее (Кожевникова и др., 2007, 2008), при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.