^ ^^^^^^ ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.275.1:612.821.6:577.3
ИНГИБИТОРЫ НЕЙРОНАЛЬНОЙ И ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ NO-СИНТАЗ УСИЛИВАЮТ ПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ КРАТКОВРЕМЕННОЙ АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ У КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСКОГО-МОЛОДКИНОЙ © 2015 г. А. Л. Крушинский*, В. С. Кузенков*, В. Е. Дьяконова**, В. П. Реутов***
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119992 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119992 Москва, ул. Вавилова, 26 ***Институт высшей нервной деятельности РАН, 117485Москва, ул. Бутлерова, 5а
E-mail: valentinreutov@mail.ru Поступила в редакцию 26.06.2014 г.
Исследовано участие оксида азота (NO) в механизмах протекторного действия при адаптации крыс линии Крушинского—Молодкиной к умеренной гипоксии, соответствующей высоте 5000 м над уровнем моря. Установлено, что селективные ингибиторы нейрональной и индуцибельной NO-синтаз (7-нитроиндазол и аминогуанидин) значительно усиливают защитный эффект кратковременной адаптации к гипоксии при развитии стрессорных повреждений у крыс этой линии.
DOI: 10.7868/S0002332915010063
В настоящее время считается общепризнанным, что токсическое воздействие глутамата, повышение внутриклеточной концентрации Са2+, оксида азота (N0) и продукта его метаболизма (диоксида азота (N0^) — ведущие факторы гибели нейронов при поражениях головного мозга (инсульте, ишемии/гипоксии, черепно-мозговых травмах, а также при нейродегенеративных процессах) (Башкатова, Раевский, 1998; Викторов 2000; Зенков и др., 2000; Меньщикова и др., 2000; Раевский и др., 2000; Реутов и др., 2011; 2012). Установлено, что токсические (100—1000 мкМ) концентрации глутамата и N0 участвуют в изменении ультраструктуры клеток молекулярного и зернистого слоев мозжечка (Ларионова и др.,
1999, 2001, 2005, 2006, 2010; Самосудова и др., 1998, 2001а, б, 2010, 2011; Вашс^иёоуа, ЯеиЬу 2011а, Ь), а также активируют процессы образования аутотипических (Самосудова и др., 2005; Самосудова, Реутов, 2013) и нейроглиальных контактов (Самосудова и др., 2007а, б).
Исследования, проводимые на культуре зернистых клеток мозжечка при сравнении повреждающего воздействия глутамата и N0-генери-рующего соединения (Пинелис и др., 1997; Сорокина и др., 1999; Гранстрем и др. 2010; Салыкина и др., 2013), а также при инкубации мозжечка с растворами этих соединений (Самосудова и др.,
2000, 2006, 2008, 2012), показывают наличие корреляции между результатами исследований на крысах линии Крушинского—Молодкиной при развитии ишемического и геморрагического ин-
сульта (Кошелев и др., 2004; Крушинский и др.,
2004, 2007; Кузенков и др., 2010-2013; Реутов и др., 2011) и клиническими данными при черепно-мозговой травме (Сорокина и др., 2002а, б, 2003а,
2005, 2009-2011). Это позволило рассматривать исследуемый нами геморрагический инсульт у крыс линии КМ как модель черепно-мозговой травмы. На основании полученных за последние десятилетия данных сделан вывод, что в ответ на воздействие токсических доз глутамата и N0-ге-нерирующих соединений включаются компенсаторно-приспособительные механизмы, способные защитить нейроны мозга от повреждения (Байдер и др., 2009; Дьяконова, Реутов, 1994, 1998; Реутов, 2004; Реутов, Орлов, 1993; Реутов и др., 1993, 2002, 2003а, б; Фадюкова и др., 2005).
Ранее на модели эпилептиформного припадка и геморрагического инсульта - крысах КМ - было установлено, что разные виды и режимы адаптации к гипоксии значительно снижают смертность, тяжесть нарушений движений и развитие внутричерепных кровоизлияний, вызванных аудиогенным стрессом (Крушинский и др., 2007). При этом значительный защитный эффект достигался при использовании адаптации в барокамере к гипоксии, эквивалентной подъему на высоту 5000 м над уровнем моря (у. м.) в течение 1 ч (кратковременная адаптация к гипоксии) (Фадю-кова и др., 2005; Крушинский и др., 2007; Байдер и др., 2009). Данный режим удобен для изучения тех механизмов, с помощью которых реализуется протекторный эффект кратковременной адапта-
ции. Анализ результатов исследований (Reutov, 1999, 2011a, b; Reutov et al., 2004, 2011a, b; Lund-berg et al., 2009; D'yakonova, Reutov, 2011; Fadyu-kova et al., 2011; Krushinsky et al., 2011; Sorokina et al., 2011) обусловил интерес к возможности усиления данного эффекта и поиску реализации этой возможности.
Ранее было установлено, что NO-генерирую-щие соединения могут оказывать разнонаправленное влияние на развитие стрессорных повреждений у крыс линии КМ в зависимости от дозы (Реутов и др., 2002). Мы получили также данные, свидетельствующие о различной роли известных форм NO-синтаз. Неселективный ингибитор NO-синтаз (L-NNA) во всех изученных дозах усиливал стрессорные повреждения, возникавшие в результате акустического воздействия, и уменьшал защитный эффект кратковременной адаптации к гипоксии (Фадюкова и др., 2005; Крушин-ский и др., 2007). Напротив, селективные ингибиторы нейрональной и индуцибельной NOS (7-нитроиндазол и аминогуанидин) значительно снижали аудиогенные стрессорные повреждения. При этом наибольший протекторный эффект наблюдался при одновременном применении ингибиторов нейрональной и индуцибельной NOS (Крушинский и др., 2008, 2010).
Цель работы — изучение возможности усиления защитного эффекта кратковременной адаптации к гипоксии при одновременном применении ингибиторов нейрональной и индуцибель-ной NO-синтаз.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты выполнены на 48 крысах линии КМ (самцы в возрасте 4—4.5 мес.). Животным первой группы (n = 16) за 70 мин до опыта вводили одновременно ингибитор индуцибельной NO-син-тазы (аминогуанидин, Sigma, США) и ингибитор нейрональной NO-синтазы (7-нитроиндазол, Sigma) в дозах 2.5 мг/100 г внутрибрюшинно. Сразу же после введения ингибиторов NOS животных помещали в барокамеру и создавали разрежение воздуха, соответствующее высоте 5000 м над у. м. Время адаптации к гипоксии составляло 1 ч. Время подъема на "высоту" и время спуска в нормальные условия составляло 5 мин. Сразу же после спуска в нормальные условия крысы подвергались акустической экспозиции. Животным второй, контрольной группы (n = 16) за 70 мин до эксперимента вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора, после чего их подвергали гипоксическому воздействию в барокамере в течение 1 ч. Затем крыс "спускали" в нормальные условия и подвергали акустической экспозиции. Третью группу (n = 16) составили интактные, не подвергавшиеся гипо-ксическому воздействию животные, которым за
70 мин до эксперимента вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора.
Акустическое воздействие проводили по ранее разработанной схеме (Крушинский, 1960). После 1.5-минутного действия сильного электрического звонка (110—115 дБ) подавали серию сильных и слабых (80 дБ) акустических сигналов длительностью 10 с с 10-секундными интервалами между ними. Через 15 мин такого воздействия делали 3-минутный перерыв и снова включали сильный звук в течение 1 мин. Во время акустического воздействия у опытных и контрольных крыс определяли параметры, характеризующие возбудимость центральной нервной системы (ЦНС): латентный период, интенсивность судорожного припадка. Также оценивали смертность животных во время звукового стресса и выраженность нарушений движений. Выделяли нарушения трех степеней: легкие (незначительные нарушения мышечного тонуса, не ограничивающие передвижение животного); средние (парез конечностей, чаще задних, затрудняющий передвижение); в) тяжелые (животное практически теряет способность к передвижению). Сразу после окончания экспериментов животных декапитировали, мозг фиксировали в 10%-ном растворе формалина. Площадь субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний определяли с помощью биноку-ляр-микрометра. Наличие или отсутствие внут-рижелудочковых кровоизлияний определяли на поперечных срезах мозга толщиной 1—2 мм. Статистическую обработку результатов проводили с применением критериев Вилкоксона и Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как и в проведенных ранее исследованиях (Фадюкова и др., 2005; Крушинский и др., 2007), кратковременная адаптация к гипоксии значительно уменьшила развитие стрессорных повреждений (рис. 1) и площади кровоизлияний (рис. 2) у крыс линии КМ. У животных, подвергшихся воздействию гипоксии, наблюдалось увеличение латентного периода судорожного припадка по сравнению с контролем (рис. 3).
Ингибиторы нейрональной и индуцибельной NOS усиливали протекторное действие кратковременной адаптации к гипоксии на развитие стрессорных повреждений (рис. 1). Это проявилось в значительном снижении смертности у животных первой группы по сравнению с животными второй (0 и 25% соответственно, р < 0.05) и доли животных с тяжелыми нарушениями движений (6.2 и 43.8% соответственно, р < 0.05). У крыс, получавших ингибиторы NOS одновременно с адаптацией к гипоксии, по сравнению со второй группой была значительно увеличена доля животных, у которых нарушения движений отсутство-
вали (50 и 6.2% соответственно,р < 0.01). Средняя площадь субдуральных и видимых субарахнои-дальных кровоизлияний (рис. 2) у опытных животных первой группы была значительно меньше, чем у животных второй (8.1 ± 4.4 и 35 ± 10.5 мм2 соответственно, р < 0.05). Частота внутрижелу-дочковых кровоизлияний также была значительно ниже в первой группе (6.3 и 43.8% соответственно, р < 0.01). У животных первой группы также наблюдалось снижение возбудимости, проявляющееся в увеличении латентного периода судорожного припадка по сравнению с животными второй (рис. 3).
К настоящему времени накоплено достаточно материалов, позволяющих предположить, что значительную роль в формировании механизмов адаптации к умеренной гипоксии играют NO (Косицын и др., 1998; Манухина и др., 2000). Проведенные нами исследования с использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и L-NNA показали, что NO участвует в протекторном эффекте кратковременной адаптации к гипоксии при развитии у крыс линии КМ аудиогенных стрессорных повреждений (Фадю-кова и др., 2005; Крушинский и др., 2007). Пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.