научная статья по теме ИНИЦИАЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ИЗ МЕГАГАМЕТОФИТОВ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ В ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЕ Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «ИНИЦИАЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ИЗ МЕГАГАМЕТОФИТОВ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ В ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЕ»

ЛЕСОВЕДЕНИЕ, 2014, № 1, с. 51-5б

_ ОРИГИНАЛЬНЫЕ _

СТАТЬИ

УДК 630: 581.16: 576.5: 582.475.4

ИНИЦИАЦИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ИЗ МЕГАГАМЕТОФИТОВ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ

В ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЕ

© 2014 г. И. Н. Третьякова, Е. В. Ворошилова

Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок, 50 E-mail: culture@ksc.krasn.ru

Поступила в редакцию 13.03.2013 г.

Рассмотрены результаты экспериментов по введению мегагаметофитов кедра сибирского в культуру in vitro на среду 1/2LV, дополненную регуляторами роста - 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) и бензиламинопурином (6-БАП). Эмбриогенная компетентность эксплантов выражалась в удлинении клеток, образовании ценоцита, смещении ядер к одному из полюсов клетки, их делении и формировании глобул эмбриоидов. Происходило образование эмбрионально-суспензорной массы. Культура мегагаметофитов кедра сибирского будет использована для размножения уникальных особей данного вида, биологическая значимость которых была предсказана Е.Г. Мининой.

Pinus sibirica, мегагаметофиты, соматический эмбриогенез, эмбрионально-суспензорная масса.

В бореальных лесах Сибири редко, но систематически встречаются уникальные формы деревьев сосны сибирской (кедра сибирского, Pinus sibirica Du Tour) с однолетним циклом развития женской шишки, у которых наблюдается акселерация генеративного цикла (женская шишка развивается 2 месяца (вместо 14-15) [1, 3]. Исследованиями, проведенными ранее, установлено, что деревья кедра сибирского с однолетним циклом развития женских шишек характеризуются интенсивным ростом и мощным развитием кроны, нарушением хода морфогенеза побегов и полового процесса, склонностью к "апомиксису" [3, 5, 9]. Это позволило расценивать данные особи как гибриды, обладающие свойствами гетерозиса.

Предыдущие исследования показали, что у рассматриваемых форм кедра сибирского проявлялось сверхраннее развитие гаметофитов. Стадия гаметогенеза у данных форм завершалась за 1.5-2 месяца вместо 1 года. Развитие архегониев шло в течение 1 недели и уже через 2-2.5 месяца после опыления созревали яйцеклетки. Однако оплодотворение не происходило из-за медленного роста пыльцевых трубок [5]. В это же время яйцеклетки у таких особей иногда подвергались гаплоидному делению, что приводило к формированию проэм-брио. Однако зародыша у особей с однолетним циклом развития женских шишек обнаружить не

удалось. Это свидетельствует, что размножение уникальных гетерозисных форм кедра сибирского естественным половым путем невозможно [8].

За последние годы в связи с интенсивным развитием лесной биотехнологии микроклонального размножения хвойных наиболее перспективным направлением является применение технологии соматического эмбриогенеза, широко используемой за рубежом при реализации программы MVF [18, 19].

В качестве источника соматических клеток для индукции соматического эмбриогенеза у хвойных используют мегагаметофиты [16], зрелые и незрелые зародыши, семядоли, гипокоти-ли, хвою [11], сегменты вегетативных побегов [15]. Для размножения уникальных особей кедра сибирского, у которых отсутствуют зародыши, наиболее перспективным является использование в качестве эксплантов мегагаметофиты, которые представляют однородную гаплоидную ткань.

Гаплоидный каллус из мегагаметофитов хвойных впервые был получен в 1985 г. у Larix decidua с целью получения эмбриогенной ткани и соматических зародышей [16], а затем у Picea abies [20, 21]. В дальнейшем эксперименты по получению и изучению гаплоидных культур и эмбриоидов не проводились, так как внимание ученых было сосредоточено на изучении соматического эм-

бриогенеза, полученного из диплоидных тканей и сеянцев для плантационного лесовыращивания. В 2009 г. нами впервые были опубликованы результаты биотехнологической работы по индукции соматического эмбриогенеза из незрелых зародышей вместе с мегагаметофитами. При этом эмбриогенный каллус развивался в единичных случаях [7].

Целью настоящей работы явилось разработка биотехнологии получения гаплоидного эмбрио-генного каллуса в культуре мегагаметофитов кедра сибирского, с последующим применением полученной биотехнологии для размножения уникальных особей данного вида. Работа посвящена памяти известного русского ученого Елены Григорьевны Мининой (к 110-летию со дня рождения).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на прививочной клоновой плантации кедра сибирского, созданной Ю.А. Череповским с сотрудниками в начале 1990-х годов на территории Даурского лесничества вблизи поселка Ермаковское (53°16'с.ш. 92°23' в.д., высота над ур. моря 300-320 м). Плантация занимает площадь 10 га. Каждый клон представлен прививками плюсовых деревьев кедра сибирского из естественного древостоя Западного Саяна и состоит из 12-15 деревьев (рамет), возрастом 18-20 лет.

Клоны кедра сибирского отличаются неравномерным урожаем женских шишек в погодичном цикле. Обильные урожаи (2009, 2011 гг.) сменяются неурожайными годами (2010, 2012 гг.). В 2012 г. на клоновой плантации урожай женских шишек практически отсутствовал. Только у пяти клонов (277/22, 281/26, 283/26, 145/4 и 153/13) были обнаружены немногочисленные женские шишки (от 1 (клон 277/22) до 7 шт. (клон 145/4)).

Для исследований по культуре ткани в первой декаде июля с каждого клона кедра сибирского проводили сбор женских шишек, полученных в результате свободного опыления. В период взятия образцов зародыши находились на кливажной и глобулярной стадиях развития.

Для введения в культуру in vitro мегагамето-фитов кедра сибирского семена предварительно обрабатывали водным раствором перманганата калия, затем отмывали в проточной воде и очищали от покровов. Извлеченные мегагаметофиты стерилизовали гипохлоритом натрия в течение 10 мин., трижды промывали в стерильной дистиллированной воде и помещали на 5 мин в 10%-й

раствор перекиси водорода. Затем в стерильных условиях мегагаметофиты рассекали на две части или отделяли сегменты, удаляли зародыш и помещали на питательную среду срезом вверх или вниз, по 6-7 эксплантов на колбу.

Для индукции соматического эмбриогенеза использовали базовую питательную среду 1/2LV [13], с добавлением сахарозы (30 г/л), глютамина (1 г/л), гидролизата казеина (0.5 г/л), мезоино-зита (1 г/л) и аскорбиновой кислоты (0.3 г/л). В качестве регуляторов роста использовали 2,4-Д и 6-БАП в концентрации 2 и 1 мг/л соответственно. Водородный показатель среды доводили до 5.8 перед автоклавированием. Помещенные на среду экспланты культивировали в темноте при 25±1°С в течение 60 суток. На 30 сутки культивирования определяли частоту каллусообразования - отношение числа эксплантов, формировавших каллус, к числу эксплантов, введенных в культуру, выраженное в процентах.

Далее образовавшийся каллус переносили на среду для пролиферации, с пониженным содержанием сахарозы (20 мг/л) и 6-БАП (0.5 мг/л). Пересадку на свежую питательную среду проводили каждые 14 суток. Для сравнения интенсивности роста культур, образующийся каллус взвешивали при каждой пересадке и брали образцы для цитологического анализа. Для его проведения готовили давленые препараты по стандартной методике [4]. Каллус помещали на предметное стекло, взвешивали, окрашивали гематоксилином с добавлением капли железных квасцов в течение 5-10 мин, добавляли каплю глицерина, накрывали предметным стеклом, после чего слегка придавливали.

Препараты просматривали с помощью микроскопа "МИКРОМЕД-6" ЛОМО, при увеличении 10X4, 10X10 и 10X40. Замеры клеток и эмбриональных структур проводили при помощи системы Scope Photo, с последующим переводом полученных единиц в микрометры. Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [2] при помощи программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При введении эксплантов кедра сибирского в культуру in vitro на 7-10 сутки культивирования происходило формирование каллуса в коррозийной полости вдоль продольной оси мегагамето-фита, расположенного срезом вверх. Каллусная масса имела белый цвет, плотную или рыхлую

9 *

Рис. 1. Культуры мегагаметофитов клонов 281/26 (а) и 283/26 (б) (бар 1 см).

структуру. У мегагаметофитов, расположенных срезом вниз, образования каллуса не происходило.

Через 1 месяц культивирования у 85% экс-плантов каллус покрывал всю поверхность среза (рис. 1). К концу стадии инициации (60-е сутки) вес каллуса составлял от 0.052±0.001 г (клон 277/22) до 0.088±0.001 г (клон 281/26) (рис. 2). Первичный отклик эксплантов составил от 20 (клон 281/26) до 85.7% (клон 145/4) (рис. 3).

При перенесении каллусов на среду для пролиферации с пониженным содержанием сахарозы и 6-БАП эмбриогенный каллус образовывался только у эксплантов двух клонов - 283/26 и 153/13. Число эксплантов, вышедших на стадию пролиферации, у данных клонов составило 68.7 и 66.7% соответственно. На 120-е сутки культивирования вес пролиферирующих каллусов составил 0.077±0.001 г (клон 283/26) и 0.098±0.001 г (клон 153/13) (рис. 2).

Каллусы, полученные от клонов 277/22, 281/26 и 145/4 характеризовались плотной структурой и оказались неэмбриогенными.

Цитологический анализ

На 7-10-е сутки культивирования мегагамето-фитов вдоль продольной оси среза наблюдалось растяжение клеток у четырех клонов, за исключением клона 277/22, у которого клетки сохраняли изодиаметрическую форму, характерную для клеток мегагаметофита. К концу первого месяца культивирования на среде для инициации образовавшийся каллус состоял из вытянутых вакуо-лизированных клеток, длина которых в среднем составляла 495±24.2 мкм. Большинство данных клеток не завершали цитокинез, в результате чего образовывались два ядра (рис. 4, а), которые делились и формировался четырехядерный цено-цит. Эти четыре ядра мигрировали к одному из концов вытянутой клетки (рис. 4, б), где происходило формирование клеточных стенок, и образовывались четыре маленькие клетки с темноокра-шенной цитоплазмой (инициалей эмбриоида). К базальному концу этих клеток примыкала безъядерная длинная клетка, которая затем, вероятно, отмирала (рис. 4, в). Инициальные клетки эмбри-

0.12. 0.1-[н

30.08-§0.06-

80.04«

0.02-

0-ЖА

1

клоны кед

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком