научная статья по теме ИНСЕРЦИОННАЯ МУТАЦИЯ В ГЕНЕ AZOBR_P60120 СОПРОВОЖДАЕТСЯ ДЕФЕКТАМИ В СИНТЕЗЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА И СВЯЗЫВАЮЩИХ КАЛЬКОФЛУОР ПОЛИСАХАРИДОВ У БАКТЕРИИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP245 Биология

Текст научной статьи на тему «ИНСЕРЦИОННАЯ МУТАЦИЯ В ГЕНЕ AZOBR_P60120 СОПРОВОЖДАЕТСЯ ДЕФЕКТАМИ В СИНТЕЗЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА И СВЯЗЫВАЮЩИХ КАЛЬКОФЛУОР ПОЛИСАХАРИДОВ У БАКТЕРИИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP245»

ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 3, с. 306-311

= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =

УДК 579.252.5:579.253.43:579.232

ИНСЕРЦИОННАЯ МУТАЦИЯ В ГЕНЕ AZOBR_p60120 СОПРОВОЖДАЕТСЯ ДЕФЕКТАМИ В СИНТЕЗЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА И СВЯЗЫВАЮЩИХ КАЛЬКОФЛУОР ПОЛИСАХАРИДОВ У БАКТЕРИИ Azospirillum brasilense Sp245

© 2015 г. Е. И. Кацы1, А. Г. Прилипов2

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов 410049

e-mail: ei_katsy@mail.ru 2Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва 123098

Поступила в редакцию 21.07.2014 г.

У бактерии Azospirillum brasilense Sp245 ранее были выявлены экстраклеточные полисахариды, связывающие краситель калькофлуор (Cal+ фенотип), и липополисахариды LPSI и LPSII с одинаковым повторяющимся звеном О-полисахарида (ОПС), но разной антигенной структурой и зарядом ОПС и/или корового олигосахарида. Несколько десятков предсказанных генов биосинтеза полисахаридов локализованы в плазмиде AZOBR_p6 штамма Sp245 (GenBank accession no. HE577333). В настоящей работе показано, что у LPSI- Cal- мутанта KM252 бактерии A. brasilense Sp245 искусственный транспозон Omegon-Km встроился в центральную часть гена AZOBR_p60120. У штамма A. brasilense Sp245 этот плазмидный ген кодирует предполагаемую гликозилтрансферазу с консервативными доменами, характерными для ферментов синтеза ОПС и капсульных полисахаридов (accession no. YP004987664); у мутанта KM252 соответствующий предсказанный белок сильно усечен и, по-видимому, полностью утратил активность. В результате анализа EcoRI фрагмента AZOBR_p6, содержащего AZOBR_p60120 и ряд других локусов, получены новые данные о структуре AZOBR_p6: закрыт ~5-тпн пробел (GenBank accession no. KM189439) в нуклеотидной последовательности этой плазмиды.

DOI: 10.7868/S0016675815030054

Альфапротеобактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae способны вступать во взаимовыгодные ассоциативные взаимоотношения с широким кругом растений [1]. Гликополи-меры клеточной поверхности важны не только для поддержания структурно-функциональной целостности этих бактерий, но и для их взаимодействий с другими организмами [1]. Одним из наиболее хорошо изученных штаммов азоспи-рилл является способный к проникновению в корни растений факультативный эндофит Azospirillum brasilense Sp245 [2, 3]. Липополисаха-рид (ЛПС, LPS) этого штамма представлен LPSI и LPSII с разной антигенной структурой и зарядом углеводной части — О-полисахарида (ОПС) и/или корового олигосахарида (трудно отделяемого от ОПС при препаративном выделении) [4, 5]. Повторяющимся звеном ОПС LPSI (с негативно заряженной углеводной частью) и LPSII (с нейтральным зарядом ОПС и/или кора) является пентасахарид, образованный остатками D-рам-нозы [5, 6]. Пока неизвестно, чем определяется отрицательный заряд ОПС/кора LPSI штамма A. brasilense Sp245. Доступных сведений о химической структуре корового олигосахарида ЛПС азо-спирилл нет. Для штаммов A. brasilense дикого ти-

па характерна способность к синтезу экстраклеточных полисахаридов, связывающих калькофлуор (ПССК) — прижизненный флуоресцентный краситель (Cal+ фенотип) [7]. К ПССК относятся эк-зополисахариды (ЭПС) и капсульные полисахариды (КПС) [7], в составе которых у бактерии A. brasilense Sp245 выявлены остатки рамнозы, галактуроновой кислоты, галактозы и глюкоза-мина [8].

Геном A. brasilense Sp245 состоит из восьми кольцевых репликонов (хромосома и семь крупных плазмид) [3], семь из которых почти полностью секвенированы [9]. С использованием методов биоинформатики показано, что плазмида AZOBR_p6 (также известная как 120-МДа плазми-да, или p120 [1, 3, 4, 10, 11]) бактерии A. brasilense Sp245 является "резервуаром" нескольких десятков предсказанных генов, кодирующих ферменты биосинтеза полисахаридов. Многие из этих генов, по-видимому, были приобретены азоспи-риллами в результате горизонтального переноса [9]. Одиночная вставка искусственного транспо-зона Omegon-Km [12] в четыре разных локуса AZOBR_p6 (p120) привела к появлению мутантов штамма A. brasilense Sp245 с фенотипом LPSI-, LPSII-, LPSI- Cal- и LPSII- Cal- [4]. Установлено,

что утрата LPSI тремя из этих мутантов явилась следствием вставки омегона в центральную часть гена (позже получившего название AZOBR_p60109 [9]), кодирующего АДФ-гептоза:ЛПС-гептозил-трансферазу (гомолог фермента RfaF, переносящего гептозу на внутренний кор ЛПС) [4, 11] (GenBank accession nos EU194338 и HE577333).

Поскольку имеется крайне мало экспериментальных данных о конкретной роли плазмидных локусов в образовании гликополимеров клеточной поверхности азоспирилл [3], целью настоящей работы стала идентификация гена AZOBR_p6, поврежденного в результате инсерции омегона у мутанта A. brasilense Sp245, дефектного по синтезу LPSI и ПССК. Секвенирование соответствующего EcoRI фрагмента плазмиды AZOBR_p6, содержащего вставку Omegon-Km, было выполнено для уточнения информации о нуклеотидной последовательности AZOBR_p6, имевшейся в базах данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали выделенный из корней пшеницы штамм A. brasilense Sp245 дикого типа [2] и его инсерционный мутант KM252 [4] со стабильным LPSI- Cal- фенотипом. Мутант A. brasilense KM252 утратил ПССК и LPSI в результате одиночной вставки Omegon-Km (KmR) в плазмиду p120 (AZOBR_p6) [4]. В качестве реципиента ре-комбинантной ДНК использовали штамм Escher-ichia coli DH1 [13]. Азоспирилл выращивали в ма-латно-солевой среде [14] с добавлением NH4Cl (1 г/л) (MSM) или в среде Luria-Bertani (LB) [13] при 30°C, а E. coli - в LB при 37°C. При необходимости в среды добавляли канамицин до конечной концентрации 30 мкг/мл.

Поскольку в составе Omegon-Km есть oriV из плазмиды pBR322 и ген устойчивости к канами-цину, процедура клонирования мутантной ДНК значительно упрощается [12]. Содержащий вставку омегона EcoRI фрагмент плазмиды AZOBR_p6 из клетокA. brasilense KM252 лигиро-вали сам на себя и клонировали в E. coli DH1 в соответствии со стандартными процедурами [13]. Сконструированную таким образом рекомби-нантную плазмиду pOmegon-Km-lpsKM252E (т.е. EcoRI фрагмент ДНК из lps мутанта KM252 со вставкой Omegon-Km) секвенировали посредством "праймерной прогулки" по ДНК [13] в прямом и обратном направлениях.

Для секвенирования ДНК азоспирилл, прилегающей к вставке омегона в плазмиде pOmegon-Km-lpsKM252E, использовали ранее подобранные [15] праймеры к концам омегона, OmeF212 (5'-TCGGGCCTTGATGTTACC-3') и OmeRuni (5'-AGGCTGGCTTTTTCTTGTTATCG-3'). В других раундах секвенирования в качестве прайме-ров подбирали олигонуклеотиды, комплементарные участку ДНК, лежащему на расстоянии не

менее 70 пн от З'-конца последовательности, определенной на предыдущем этапе. При неоднозначных результатах, связанных с присутствием в составе плазмиды pOmegon-Km-lpsKM252E (и соответственно AZOBR_p6) длинных нуклео-тидных повторов, в качестве матрицы для секве-нирования использовали изолированные фрагменты плазмиды pOmegon-Km-lpsKM252E.

Для заполнения пробела в нуклеотидной последовательности плазмиды AZOBR_p6 использовали следующие праймеры: 5'-CGCCGACCG-GTACAAGAGAC-3'; 5'-GATGGCGTCGAACAG-CAGGAT-3'; 5'-CGAGGGCGCCCAGGTCAAC-3'; 5'-CGCGCGGGCTTTGTTCTTTA-3'; 5'-CAAC-GCCTATTTTCTGCCCTACCT- 3' ; 5'-GATCGC-CCACTCGCCGTTCA-3'; 5'-CGGTAACGCTGC-CCACTGAG-3'; 5-GACGGCGTGCGCGACCT-CAAG-3'; 5 ' - CCCAGTACCAGGTGTTCTTGAC-3'; 5'-GCATGACGCGCCTGACTTG-3'; 5'-TCG-GCTCGAACGCCTCGTAC-3'; 5'-CGTCAGCCA-CATCGTGAAAGA- 3 ' ; 5'-GACCCACCCCTC-GAACCACTCCT-3'. Все праймеры синтезировали в Научно-производственной фирме "Литех" (Москва, Россия).

Матрицы для секвенирования подготавливали с применением системы очистки ДНК Wizard Plus SV Minipreps (Promega, США). Реакции секвенирования ставили с использованием набора Big-Dye Terminator v. 3.1 Cycle sequencing kit в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems, США). Продукты реакций секвениро-вания анализировали на автоматическом ДНК секвенаторе ABI Prism 3130 Avant (Applied Biosystems, США).

Новые нуклеотидные последовательности, выявленные в AZOBR_p6, транслировали в шести возможных рамках считывания и анализировали все открытые рамки считывания длиной более 100 пн. Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программы и базы данных, представленные на серверах NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/] [16, 17], SMART [http://smart.embl-heidelberg.de/] [18], PSORTb [http://www.psort.org/psortb/] [19], LipoP, SecretomeP, TatP и SignalP [http:// www.cbs.dtu.dk/services/] [20—23]. Новую информацию о нуклеотидной последовательности плазмиды AZOBR_p6 депонировали в GenBank под номером KM189439.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика гена плазмиды AZOBR_p6, поврежденного вставкой Omegon-Km у мутанта штамма A. brasilense Sp245, утратившего

способность к синтезу LPSI и полисахаридов, связывающих калькофлуор

Ранее было установлено, что из двух форм ЛПС, выявляемых у бактерии A. brasilense Sp245, мутант KM252 (с одиночной вставкой Omegon-

308

КАЦЫ, ПРИЛИПОВ

Q

ф-1 ^///////////////^^^ \

AZOBR_P60119 AZOBR_P60120 AZOBR_P60122

Схема участка плазмиды AZOBR_p6 (accession no. HE577333) бактерии Azospirillum brasilense Sp245, содержащего вставку инсерционного элемента Omegon-Km у LPSI- Cal- мутанта KM252. Горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции, вертикальной стрелкой — место вставки омегона (Q). Масштабная линейка соответствует 1 тпн.

Km в плазмиде p120/AZOBR_p6) синтезирует только LPSII с нейтральным зарядом углеводной компоненты [4, 5]. Выросшие на плотной среде с прижизненным красителем калькофлуором колонии мутанта KM252, в отличие от колоний родительского штамма Sp245, не флуоресцируют под ультрафиолетом и, по-видимому, не содержат П^К [4].

Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pOmegon-Km-lpsKM252E показал, что у LPSI- Cal- мутанта KM252 дефектен локус AZOBR_p60120 (accession no. HE577333). Вставка 3.8-тпн Omegon-Km (по краям которого находятся стоп-кодоны трансляции во всех рамках считывания [12]) локализована за 1145-й пн кодирующей последовательности (CDS) AZOBR_p60

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком