ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 541.123:546.21 '231 '832
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСТВА В МИКРОБНЫХ ТОПЛИВНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МУТАНТОВ ЗИЕЦШЕЬЫ ОШЮЕЖШ MR-1 C ПОВЫШЕННОЙ РЕДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
© 2013 г. Т. А. Воейкова*, 1, Л. К. Емельянова*, Л. М. Новикова*, Р. С. Шакулов*, К. В. Сидорук*, И. А. Смирнов**, В. К. Ильин**, П. Е. Солдатов**, А. Ю. Тюрин-Кузьмин**,
Т. С. Смоленская**, В. Г. Дебабов*
*ФГУПГосударственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр РФ — Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 06.12.2012 г.
Анализ уровня электрогенности мутантов и РЯВ1 штамма Shewanella опв1ёвт18 МЯ-1 с повышенной на 30—40% редуцирующей активностью по сравнению с исходным штаммом проводили в микробных топливных элементах (МТЭ) различных конструкций, разработанных в ходе исследований. Показано, что в МТЭ напряжение и плотность электрического тока, создаваемого мутантами, возрастали в 1.7 раза по сравнению со штаммом £ oneidensis МЯ-1. Таким образом, установлена корреляция между уровнем редуцирующей активности клеток и уровнем напряжения и плотностью электрического тока, создаваемого в МТЭ мутантными штаммами. В работе впервые продемонстрирована возможность интенсификации получения биоэлектричества в МТЭ путем генетического изменения бактерий & oneidensis МЯ-1.
Ключевые слова: микробные топливные элементы, бактерии-электрогены, редуцирующая активность.
DOI: 10.7868/S0026365613040137
Поиск альтернативных способов получения энергии из возобновляемых источников органического сырья привел к созданию микробных топливных элементов (МТЭ) (microbial fuel cells, MFC), в которых получение электрического тока происходит за счет окисления органических соединений электрогенными микроорганизмами в анаэробных условиях [1]. Эти бактерии в процессе жизнедеятельности осуществляют транспорт электронов на внешнюю поверхность клеточной мембраны, затем электроны могут быть акцептированы экзогенными и эндогенными медиаторами переноса электронов (красителями, хинона-ми, рибофлавином и др.) или же анодом МТЭ [2]. В результате этих процессов в МТЭ регистрируется электрический ток. Возможность получения дополнительной электроэнергии в процессе переработки микроорганизмами органических отходов пищевой промышленности, сельского хозяйства, очистных сооружений, делает актуальным иссле-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: voeikova@genetika.ru).
дования по оптимизации работы МТЭ [3]. Рассматривается возможность получения электричества с применением МТЭ для питания приборов в отдаленных и труднодоступных регионах [4], в замкнутых системах, таких как подводные лодки, орбитальные космические станции и, в будущем, межпланетные корабли [5]. К преимуществам подобных технологий можно отнести их экологическую безопасность, возможность сочетать процессы утилизации отходов с получением электроэнергии, длительное время функционирования каждой установки.
Для исследования процессов генерации электронов микроорганизмами используют штаммы родов Shewanella, Geobacter, Aeromonas и др., однако наиболее изученным является штамм S. oneidensis МЯ-1, грамотрицательная факультативно анаэробная у-протеобактерия, обнаруженная на дне пресноводных водоемов, морей, в осадочных отложениях, почве. Штамм S. oneidensis МЯ1 является объектом генно-инженерных исследований, для него определена полная нуклеотидная после-
довательность хромосомной ДНК [6], разработаны методы обмена генетическим материалом [7], созданы модели МТЭ, работающие на различных органических субстратах.
В настоящее время мощность тока, получаемого в МТЭ, невысока, и для промышленного применения МТЭ должны быть усовершенствованы. Оптимизация работы МТЭ может идти как по пути технического усовершенствования конструкций, так и путем генетической модификации микроорганизмов. С помощью изменения технических параметров МТЭ удалось увеличить плотность тока от 0.1 мВ/м2 до 4.3 В/м2, при этом электрического тока, образуемого бактериями, достаточно для питания приборов с малым энергопотреблением [8, 9]. Однако практически нет научных публикаций, в которых уровень электрического тока в МТЭ повышался бы за счет генетической модификации микроорганизмов. Одним из решений задачи повышения эффективности МТЭ является перестройка окислительных процессов в Б. oneidensis ЫЯ-1 и увеличение скорости генерации электронов. Ранее нами была поставлена и решена задача получения мутантов Б. oneidensis ЫЯ-1 с повышенной редуцирующей активностью и более интенсивным потреблением лактата [10]. Мутанты БЯБ1 и БЯ81 были получены по признаку устойчивости к антибиотику фос-фомицину, токсичному аналогу фосфоэнолпиру-вата. Поскольку фосфоэнолпируват играет центральную роль в углеродном метаболизме, мы предполагали, что среди фосфомицин-устойчи-вых мутантов могут присутствовать варианты с усиленной функцией ферментных систем, обеспечивающих транспорт и окисление углеводов, образование восстановленных NAD(P)H эквивалентов и биосинтез АТФ. Было установлено, что уровень потребления лактата возрастал у штаммов БЯ81 и БЯБ1 на 10 и 30% соответственно, по сравнению с исходным штаммом. Редуцирующая активность мутантов, определяемая по скорости обесцвечивания красителя метиленового синего суспензиями клеток одинаковой оптической плотности, была выше примерно на 30—40% по сравнению с исходным штаммом.
Основной задачей настоящей работы был сравнительный анализ уровня напряжения и плотности электрического тока, создаваемого в МТЭ мутантами БЯ81, БЯБ1 с повышенной редуцирующей активностью, и исходным штаммом Б. oneidensis ЫЯ-1. Для решения этой задачи были оптимизированы условия культивирования штаммов в аэробных и анаэробных условиях, определены титры клеточных суспензий для инкубации в МТЭ, сконструированы лабораторные макеты МТЭ двух видов, установлены параметры работы МТЭ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы. Мутанты с повышенным уровнем редуцирующей активности FRS1 (Fosfomycin Resistant Small) и FRB1 (Fosfomycin Resistant Big) штамма Shewanella oneidensis MR-1 были получены ранее [10]. Штамм S. oneidensis MR-1 получен Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика из коллекции микроорганизмов Института Па-стера (№ CIP106686, Франция).
Среды и условия получения биомассы клеток штаммов для МТЭ. Штаммы выращивали на ага-ризованной среде TSB (Tryptic Soy Broth, "Sigma", 40 г среды и 17 г агара на 1 л дистиллированной воды) в течение 24 ч при 30°С. Затем клетки переносили с агаризованной среды в физиологический раствор и полученной суспензией клеток засевали жидкую среду TSB, внося по 1.0 мл суспензии в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды. Колбы инкубировали в аэробных условиях при 30°С на круговой качалке при 220 об/мин в течение 18 ч. Затем культуры центрифугировали при 6000 g в течение 20 мин, надо-садок сливали, осадок промывали физиологическим раствором, вторично центрифугировали при тех же условиях. К полученной биомассе клеток добавляли 1.0 мл стерильной дистиллированной воды и переносили в синтетическую среду MM [8], содержащую 4 г/л лактата. Образцы всех штаммов уравнивали по оптической плотности для последующего внесения в анодные камеры в МТЭ.
Характеристика МТЭ. Работу проводили на двух установках — МТЭ1 и МТЭ2, отличающихся конструктивными параметрами. Регистрацию уровня напряжения, создаваемого штаммами в МТЭ1 и МТЭ2, осуществляли различными способами.
МТЭ1 представляет собой двухкамерную электрохимическую ячейку с катионообменной мембраной МК-40 (ОАО "Щекиноазот", Россия). Объем каждой из камер — катодной и анодной — составлял 295 см3. Анод и катод выполнены из углеродного материала, площадь анода 64 см2, площадь катода 15.5 см2. Анод соединен с катодом электрической цепью с резистивной нагрузкой 150 кОм. Регистрацию электрических параметров МТЭ1 осуществляли в течение всего эксперимента с частотой 1 раз в 10 мин при помощи АЦП Е-270 фирмы "LCard" (Россия) с использованием программы LabView (США).
МТЭ2 представляет собой многокамерную электрохимическую ячейку с катионообменной мембраной из Nafione ("DuPont", США), общей катодной камерой и набором изолированных анодных камер. Объем одной анодной камеры 13 см3. Анод представляет собой комбинированную конструкцию, состоящую из графитового стержня и диска из графитированной ткани. Диаметр стерж-
Субстрат
Продукты окисления
Рис. 1. Принципиальная схема микробного топливного элемента (МТЭ).
ня 0.5 см2, высота 9.0 см2, площадь 14.1 см2, диаметр диска 1.6 см2, площадь 2.0 см2. Катод выполнен из графитированной ткани площадью 150 см2. Регистрацию электрических параметров в МТЭ2 осуществляли 1 раз в сутки, измеряя ток и напряжение с помощью амперметра и вольтметра.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Потребление органических субстратов мутантами FRS1 и FSB1. Штамм Shewanella oneidensis MR-1 не способен метаболизировать экзогенную глюкозу, поэтому в экспериментальных условиях в МТЭ обычными источниками углерода и электронов для представителей Shewanella служат лак-тат, формиат или ацетат [11]. Лактат используется электрогенными штаммами для строительства новых клеток, а также в качестве источника электронов в процессе метаболизма. Формиат может использоваться клетками в качестве источника электронов при окислении его на поверхности клеток и в периплазме. Эксперименты, проведенные с живыми отмытыми от питательной среды клеткам Shewanella, показали, что добавление натриевой соли формиата в концентрации 0.1% к клеточной суспензии существенно ускоряет время обесцвечивания метиленового синего (МС). Так, время обесцвечивания МС клетками S. oneidensis MR-1, находящимися в воде без формиата и с фор-миатом составляло 225 и 115 с, соответственно. Скорость обесцвечивания МС мутантом FRS1 в воде без формиата и с формиатом составляла 135 и 40 с соответственно. Т.е. в присутствии формиа-та время обесцвечивания МС исходным штаммом сокращалось прим
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.