ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2004, том 23, № 7, с. 68-74
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКЕ
УДК 535.379; 541.127
ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭНЗИМАТИЧЕСКИ ЗАПУСКАЕМОЙ ЭЛЕКТРОНООБМЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ТРИГГЕРНОГО ДИОКСЕТАНА КАК ФУНКЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ СРЕДЫ
© 2004 г. А. В. Трофимов
Институт биохимической физики Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 04.08.2003
Запускаемая щелочной фосфатазой электронообменная хемилюминесценция триггерного спиро-адамантил-замещенного диоксетана (аналога биолюминесценции светляка), широко используемая в современных методах иммуноанализа, проявляет ярко выраженную рН-зависимость с максимумом при рН = 9. Кинетический анализ показывает, что единственной рН-зависимой стадией этого
2_
процесса является снятие щелочной фосфатазой защитной группы (Р03 ) в арильном фрагменте диоксетана (так называемый энзиматический триггеринг), инициирующее хемилюминесценцию. Наблюдаемая рН-зависимость отражает переключение лимитирующей стадии процесса с дефосфо-рилирования энзима на фосфорилирование последнего с ростом рН.
ВВЕДЕНИЕ
Важнейшее свойство диоксетанов и диоксета-нонов (а-пероксилактонов) состоит в том, что эти четырехчленные циклические пероксиды являются по сути резервуарами химической энергии, которая может быть эффективно преобразована в свет при распаде таких напряженных циклов [1]. Наиболее яркий тому пример - биолюминесценция светляка, возникающая, как полагают, при распаде короткоживущего диоксетанона - промежуточного продукта люциферин-люцифераз-ной реакции [2]. Помимо того, что это восхитительное по красоте явление живой природы, это еще и самый эффективный из известных хемилю-минесцентных процессов (его квантовый выход составляет более 90%) [3]. Последнее обстоятельство определило практический интерес к лю-циферин-люциферазным системам, вылившийся в разработку на их основе самых разнообразных хемилюминесцентных биоаналитических методов [3-5]. Элементарным актом генерации возбужденных состояний в таком хемилюминесцент-ном процессе, по-видимому, является внутримолекулярный перенос электрона (ПЭ) с фенолятной группы на пероксидную цепочку в промежуточном диоксетаноне (так называемая химически инициированная электронообменная люминесценция (ХИЭОЛ)) [2]. Выделение такого пероксида позволило бы существенно расширить технические возможности хемилюминесцентных методик. Но так как практически это едва ли осуществимо, было предпринято немало усилий для создания его устойчивого синтетического аналога, который обладал бы склонностью к селективным реакциям с определенными агентами - триггерами,
запускающими таким образом хемилюминес-центный процесс [3]. На Схеме 1 показан наиболее удачный вариант синтетического диоксетана (АМРРБ) [3-5], являющегося функциональным аналогом интермедиата в механизме биолюминесценции светляка.
Детали механизма генерации возбужденных состояний в реакциях диоксетанов типа АМРРБ и особенности сольватохромизма эмиттеров ХИЭОЛ подробно изложены в наших недавних работах [6-10].
Диоксетаны - производные АМРРБ ныне наиболее широко используются в качестве хемилюминесцентных субстратов в самых разнообразных аналитических методиках молекулярной биологии и клинической биохимии [3-5]. Избирательная чувствительность такого субстрата по отношению к определенному триггеру-реагенту, инициирующему электронообменную хемилюминесценцию (ХИЭОЛ), определяется подбором защитной группы (Схема 1), предотвращающей внутримолекулярный перенос электрона с фенолята на пероксидную цепочку. Устранение защитной группы под действием триггера оголяет фенолят-ион, инициируя таким образом перенос электрона с этого фрагмента на пероксидную группу. Распад диоксетанового цикла, вызванный переносом электрона, сопровождается образованием возбужденного эмиттера ХИЭОЛ. В молекуле АМРРБ, изображенной
на Схеме 1, защитной группой является Р0^. Эту группу можно устранить щелочной фосфатазой -популярнейшим в иммунохимии реагентом. Таким образом, АМРРБ - избирательный индикатор на щелочную фосфатазу, а интенсивность его ХИЭОЛ пропорциональна концентрации этого энзима в пробном растворе.
Схема 1
Промежуточный диоксетанон (предшественник эмиттера
Схема 2
O—O
o-po3-
Щелочная фосфатаза
wHPO4
O—O
O—O
+H+
OH
O_
ПЭ
O
O
O
MeO
MeO
T
hv
O
O_
Для рационального выбора оптимальных условий проведения хемилюминесцентного анализа на щелочную фосфатазу с помощью AMPPD важно понимать зависимость ХИЭОЛ от свойств среды, из которых рН является важнейшим. Действительно, как показано на Схеме 2, по сути в каждой стадии этого сложного энзиматического процесса генерации ХИЭОЛ участвуют либо ионы Н+, либо НО-.
Протонирование оксибензоат-иона 4 - эмиттера хемилюминесценции (ХИЭОЛ) не показано на Схеме 2, так как в условиях эксперимента (щелочные рН) такой процесс не может оказать существенного влияния на возбужденный эмиттер [6].
В настоящей работе изложено детальное исследование рН-зависимости хемилюминесцентного процесса, изображенного на Схеме 2.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовались коммерчески доступные реагенты, готовые к биоаналитическому применению - образцы AMPPD производства "Applied Biosystems" (Bedford, MA, USA) и щелочная фосфатаза Biozyme ALPI 12G (from "bovine calf intestine or mucosa") производства Biozyme (UK).
Фенил-замещенный диоксетан 2-H [3(2'-спиро-адамантан)-4-метокси-4(3"-гидрокси)фенил-1,2-ди-оксетан] был приготовлен по известной процедуре [11]. Образец (500 мг) метокси(3-гидроксифе-нил)метиленадамантана (производства "Applied Biosystems") растворялся в 5 мл метиленхлорида,
+
3
Интенсивность ХИЭОЛ, произв. ед.
50
i = Фчг,
(1)
40
30
20
10
9.0
9.5
10.0 10.5 pH
Рис. 1. рН-Зависимость интенсивности хемилюминес-ценции (ХИЭОЛ) 1 мМ диоксетана 1 (см. Схему 2),
то вид зависимости на рис. 1 определяется либо рН-зависимостями vcat(pH и Ф(рН), либо суперпозицией Vca/рН) и Ф(рН).
Как следует из соотношения
N
hv
= J idt = ф| vcatdt = Ф[ 1 ],
(2)
инициированной 4.7 • 10-13 М щелочной фосфатазы при 37°C в карбонатном буфере (0.05 М) в присутствии 1 мМ MgCl2.
после чего в раствор добавлялось 10 мг тетрафе-нилпорфина и раствор охлаждался в ванне с этанолом до -10°C. Затем раствор облучался в течение 30 мин светом двух натриевых ламп (Philips G/98/2-SON, 150 Вт) при одновременном пропускании кислорода. По завершении фотолиза растворитель испарялся при пониженном давлении (20 Торр) и 20°C. После хроматографической очистки осадка на силикагеле было получено 320 мг продукта (57%) в виде масла палевого желтого цвета.
Хемилюминесценция регистрировалась при помощи установки Митчела-Хастингса (Mitchell-Hastings) [12]; детали экспериментальной процедуры идентичны тем, что были использованы в наших предыдущих работах [6-10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Зависимость интенсивности хемилюминесцен-ции от рН среды показана на рис. 1. Видно, что эта зависимость проходит через максимум примерно при рН-9.
Так как интенсивность хемилюминесценции i определяется скоростью энзиматического катализа vcat (лимитирующая стадия брутто-процесса, изображенного на Схеме 1) и квантовым выходом хемилюминесценции Ф:
выход хемилюминесценции легко определить, измерив количество света Nhv, испущенное при полном распаде диоксетана 1, катализированном щелочной фосфатазой в высокой концентрации (10-8 М). Эти измерения показали, что Ф = Nhv/[1] не зависит от рН и составляет (7.5 ± 0.3) • 10-6 при 37°C в карбонатном буфере (0.05 М) в присутствии 1 мМ MgCl2.
Поскольку Ф не зависит от рН, то вид кривой на рис. 1 обусловлен рН-зависимостью скорости энзиматического дефосфорилирования диоксета-нового субстрата 1, т.е. v^/рН). A priori ясно, что вид зависимости v^/рН) должен определяться влиянием рН на лимитирующую стадию энзиматического процесса (Схема 1) и концентрацию каталитически активных форм энзима. Влияние рН на концентрацию активных форм энзима может складываться как из прямых изменений в активном центре (Ser-O) [13], так и вблизи последнего. Для качественного объяснения рН-эффекта следует воспользоваться упрощенным общим подходом [14], предполагающим, что активная форма энзима ЕН+ подвергается инактивации как при протонировании с падением рН, так и при депро-тонировании с ростом рН. Таким образом, можно считать, что в отсутствие субстрата каталитически активная форма энзима ЕН+ находится в равновесии с неактивными протонированной и депротони-
рованной формами Е и Е (Схема 3). Фракциями же более протонированных и депротониро-ванных форм в общей
Схема 3
Е H
2 +
+H+
ЕН+
+H+
E
концентрации энзима в данном приближении можно пренебречь [14].
Для рассмотрения взаимодействия активной формы энзима ЕН+ с диоксетановым субстратом 1 удобно воспользоваться схемой Михаэлиса-Ментена (Схема 4). В этой схеме после формирования нековалентного комплекса Михаэлиса ЕН+ • 1
о
о
+
+
2
Схема 4
2-Н
Ъ5-
ЕН+ + 1Л
к-5
ЕН+ • 1
ЕН
Р03 + 2
НО-
2-
НР0
4
Уса, =
к с а , е О I- 1 ]
[1] + К
(3)
м
(()-1 =
1
Фк
са, О
1+Й
(4)
Интенсивность ХИЭОЛ, произв. ед.
50-
----------------ЕН+ 3 + 4
катализ щелочной фосфатазой происходит через фосфорилирование энзима [15], т.е. через формирование интермедиата ЕН+ ■ Р0-. Регенерация
свободного энзима из ЕН+ ■ Р03 осуществляется эффективно при высоких рН, в то время как при низких рН этот процесс медленный и, следовательно, он лимитирует скорость энзиматического брутто-процесса [16]. Таким образом, рост рН может вызвать переключение лимитирующей стадии с дефосфорилирования энзима на его фосфорилирование.
При низких концентрациях энзима скорость каталитического процесса может быть выражена соотношением Михаэлиса:
40 -
30 -
20 -
10
в котором е0 - полная концентрация энзима, кса, -брутто-константа скорости каталитического процесса, а Км - константа Михаэлиса. Отсюда влияние рН на чса, может быть суперпозицией рН-за-висимостей кса, и Км. Каталитические параметры кса, и Км легко определить из концентрационной зависимости интенсивности хемилюминесценции. Действительно, из (1) и (3) следует соотношение
для линейной анаморфозы зависимости г от [1]. Н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.