МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 525-528
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.174
ИНТРИГУЮЩАЯ МОДЕЛЬ ДИСПЕРСИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5S рДНК В ГЕНОМЕ ПРЕСНОВОДНОГО ХВОСТОКОЛА Potamotrygon motoro
(Chondrichthyes: Potamotrygonidae)
© 2015 г. V. P. Cruz*, C. Oliveira, F. Foresti
Departamento de Morfología, Instituto de Biociencias, Universidade Estadual Paulista — UNESP, campus de Botucatu, 18618-000Botucatu, SP, Brasil Поступила в редакцию 08.08.2014 г.
Принята в печать 21.10.2014 г.
Гены 5S рибосомной ДНК (рДНК) глазчатого хвостокола (Potamotrygon motoro) амплифицировали методом ПЦР, очищали, клонировали и секвенировали. В результате получены два класса сегментов, отличающихся по длине. Самый маленький сегмент, размером 342 п.н., отнесен к классу I, самый большой, размером 1 900 п.н., обозначен как класс II. При сравнительном анализе выровненных нуклеотид-ных последовательностей обоих классов выявлено несколько изменений оснований в генах 5S рДНК. В нетранскрибируемых спейсерных областях (NTS-области) класса I обнаружены TATA-подобные последовательности, а в NTS-области 5S рДНК класса II микросателлитная последовательность (GCT)10. Полученные результаты внесут вклад в понимание молекулярной организации рибосомальных генов и механизмов генетической дисперсии.
Keywords: Elasmobranchii, Potamotrygon, хвостокол, 5S рДНК, клон, микросателлит.
AN INTRIGUING MODEL FOR 5S rDNA SEQUENCES DISPERSION IN THE GENOME OF FRESHWATER STINGRAY Potamotrygon motoro (Chondrichthyes: Potamotrygonidae), by V. P. Cruz*, C. Oliveira, F. Foresti (Departamento de Morfologia, Instituto de Biociencias, Universidade Estadual Paulista — UNESP, campus de Botucatu, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil; *E-mail: cruzvp@outlook.com). 5S rDNA genes of the stingray Potamotrygon motoro were PCR replicated, purified, cloned and sequenced. Two distinct classes of segments of different sizes were obtained. The smallest, with 342 bp units, was classified as class I, and the largest, with 1900 bp units, was designated as class II. Alignment with the consensus sequences for both classes showed changes in a few bases in the 5S rDNA genes. TATA-like sequences were detected in the non-transcribed spacer (NTS) regions of class I and a microsatellite (GCT)10 sequence was detected in the NTS region of class II. The results obtained can help to understand the molecular organization of ribosomal genes and the mechanism of gene dispersion.
Keywords: Elasmobranchi, Potamotrygon, stingray, 5S rDNA, clone, microsatellite.
DOI: 10.7868/S0026898415030039
В организмах эукариот гены рибосомной ДНК (рДНК) представлены двумя мультигенны-ми семействами, 458 рДНК и 58 рДНК, которые состоят из тандемно повторяющихся звеньев, в сотнях тысяч копий рассредоточенных по геному [1]. Повторы гена 58 рДНК содержат как кодирующие 120-членные последовательности, так и нетранс-крибируемые спейсерные участки (МТ8-обла-сти); причем для нуклеотидной последовательности последних характерна вариабельность, что обусловлено наличием вставок/делеций, мини-репликаций и псевдогенов [1]. Нуклеотидная последовательность кодирующей части гена 58
* Эл. почта: cruzvp@outlook.com
рДНК отличается высокой консервативностью даже между неродственными видами, в то время как изменения в NTS-областях встречаются очень часто и в основном видоспецифичны [2—4], что с успехом используется в исследованиях механизмов эволюции [5—7].
Если предположить, что исследуя разнообразие видов рыб в Неотропической области можно понять механизмы, вовлеченные в динамику NTS, изучение этих маркеров представляет большой интерес. В представленной работе мы провели расширенный анализ 5S рДНК у пресноводного хвостокола Potamotrygon motoro с целью определить организацию двух сегментов, идентифицированных в NTS-области этого гена.
Проанализированы образцы пресноводного хвостокола P. motoro, собранные в верховьях реки Парана (Upper Paraná River, Бразилия) и хранящиеся в музее Лаборатории биологии и генетики рыб (Laboratorio de Biologia e Genética de Peixes, Ботука-ту, Бразилия; свидетельство 5202/5203/6716/6717). Геномную ДНК экстрагировали из образцов ткани печени и очищали, как описано ранее [8]. Выделение 5S рДНК проводили с помощью ПЦР [9] с использованием праймеров 5SA (5'-TACGC-CCGATCTCGTCCGATC-3') и 5SB (5'-CAG-GCTGGTATGGCCGTAAGC-3'). Фрагменты 5S рДНК, генерированные ПЦР, клонировали в плазмиде pGEM-T ("Promega") и использовали для трансформации Escherichia coli DH5a. Клоны, полученные на основании ПЦР-продуктов 5S рДНК, секвенировали на автоматическом секве-наторе ABI Prism 377 ("Perking-Elmer") с использованием набора Dye Terminator Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer"), согласно инструкции производителя. Нуклеотид-ные последовательности анализировали с помощью основного инструмента поиска локального выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool, BLASTN) [10]. Для поиска последовательностей использован веб-сайт NCBI (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/blast) [11]. Выравнивание последовательностей проведено с помощью программного обеспечения Clustal W [12], реализованного в программе Dambe [13]. Консенсусные последовательности генерировали вручную, используя программное обеспечение BioEdit [14].
В результате ПЦР-амплификации геномной ДНК P. motoro получены два мажорных продукта, электрофоретическая подвижность которых соответствует приблизительно 342 п.н. и 1 900 п.н., а также яркая полоса размером около 600 п.н. — из чего следует вывод о существовании, по меньшей мере, двух семейств генов 5S рРНК. Главные ПЦР-продукты элюировали из геля и клонировали.
Приблизительно 10 клонов каждой полосы секвенировали, причем для полосы 1 900 п.н. проводили сиквенс только фланкирущей области. Выявляли консенсусные последовательности и определяли в них содержание GC-нуклеотидов: оно составило 47.3% для 342-членной полосы
(класс I) и 57% для полосы 912 п.н. (класс II) (рисунок). Низкий уровень генетической дивергенции обнаружен среди клонов класса I (0.7%), похожий результат получен и для клонов класса II (0.8%) (таблица).
Несмотря на то, что в ходе эволюции геномная область 58 рДНК оставалась высококонсервативной, в проанализированных сегментах идентифицированы характеристические нуклеотидные замены для каждого типа повтора. Так, показано, что уровни экспрессии этого гена сильно различаются у животных [15] и растений [16] — в основном из-за вариаций в рассеянных по геному НТВ-областей.
В результате исследований нескольких видов рыб идентифицированы разные типы генов 58 рДНК, организованные в тандемные повторы с заметными различиями в МГ8-областях, так что существование двух классов гена 58 рДНК, по-видимому, общая особенность генома рыб. Оба класса обнаружены во многих видах рыб: Charac-iformes [17], Symbranchiformes [18], Perciformes [19], Carcharhiniformes [20], Rajidiformes [21], Milyobati-formes [22], Gadiformes [3] и Polypteriformes [23]. Авторы отмечают, что семейства 58 рДНК могут эволюционировать в ходе как согласованного процесса, так и/или процессов рождения-и-гибе-ли, а присутствие двух классов генов 58 рДНК в нескольких неродственных видах рыб указывает на общий принцип организации этого гена в их геномах.
В то время как МГ8-области, скорее всего, не имеют определенной функции, геномные сегменты, идентифицированные как ТАТА-подоб-ные последовательности (модифицированные как ААТТ и ТТАА), найдены у нескольких млекопитающих и локализованы они в основном вблизи МГ8-областей. В геноме рыб ТАТА-подобные последовательности обнаружены в левом элементе оперона гена 58 [17]. У морских скатов также обнаружены ТАТА-подобные тетрануклеотидные последовательности в 58 рибосомальном гене [21, 24] — как это показано для P. motoro (рисунок). Присутствие микросателлитной последовательности ^СТ)10 в составе гена 58 рДНК P. motoro также усиливает высокодинамичный характер
Анализ генетических расстояний 58 рДНК повторов класса I и класса II в клонах Potamotrygon motoro*
Класс I Класс II
5S рДНК NC BP GD ± SD NC BP GD ± SD
P. motoro 09 342 0.007 ± 0.003 08 912 0.008 ± 0.004
* N0 — число клонов; ВР — число п.н.; GD — генетическая дивергентность; SD — стандартное отклонение.
ИНТРИГУЮЩАЯ МОДЕЛЬ ДИСПЕРСИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5S рДНК
527
5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S 5S
caggctggtatggc gtaagctac gcccgatctc gtccgatctc ggaagc ..........................................с.....с.
taagcaggctcaggcctggttagtacttggatgggagacc gcctgggaat
. GG. . . A..........С . . . CA. G. С . CTG .A.....T...........
ACCAGGTGCCGTAGGCTTTTGCTGTTTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG
T......Т.Г...СА. .GA.A.ACG.GA.T.A-____Т. . C.CT. . CAAA
CTGCTGCTCTGAACAGATGTCCGCAGTAGGAGCTGCTCTCTTCTTTTCAG
Т...А.X■-....TTC■ATCAT.TTA■GACCA....------..C..A..
TCCGCCTCTGACATACACTGTCGGCACTGCGCTTCTCACTCAGCCCAGAA ---.GT...TTT.С...G.AAG.AA
. 1TA ftA------GA. T . TGGGGA.
ACGCAAGCACCCGGCTCCTGCTGTCAAGGCACAGGAATACAAGAATGTGC .G...G.T.GAT.AA----....—.GCTT..G>CC••.. С..С С..A—
TTTTGCGAGGCAGCCAGCTGCACCTGCAGCACTAGCGTCCTCATTGCTTC
-C..A..GCCATA.....CAGG.T.A■G..CA.■С.AG...G--------
CTCCATACCGCCGCGCATCGCCACTCGCCTACTGTCGCCTCTCCCTCAGT
CTCAGCCAGGCAGCAAGATGCAAGATGCAAGGGGCTCAAGCGTTCTTGCG
CCTCTCTTCTGCGCTTGCGCAAACCGTCCATTCTCAGTTGAGGCTTTCCT
TTGCCTTCTGAGCAGGCATCAGCAAAGGCGGCAGCTGCTTCCTGCGGCCA
AGC GGGCTGGCC GAGTAT GGCACAAGCAGCT СYGAATAGC CT CTGATGGC
TGAGACTCAGCAGCCTGTTCCTGAGCGAGCCGTCGGCCTGGCAGTGGGCA
GAC TCACCCAGGCCCACCCAGGTCT GA GGAC GGTTAGCTCAGCTGGTCAG
AGCGTTGCTAATAACGCCAAGGTCGTGGGTTCGATCCCCATACTGTCCAC
GCCCCGCATTTCCTTTAATTTCCGCCCACTTTCGTCCAGCAGTCCAGCAC
TTCTCTGGCTATCCAATGTAGGACATGGCTGGATGGCKGGCGCTTCAGCA
GAAAAGCAGGCCCCGTGCAGTATGCAGCAGCC TAAT TCACGGGAACTGAA
TGAATGAACGAA [912] ------------ [912]
[ 50] [ 50] [100] [100] [150] [150] [200] [200] [250] [250] [300] [300] [350] [350] [400] [400] [450] [450] [500] [500] [550] [550] [600] [600] [650] [650] [700] [700] [750] [750] [800] [800] [850] [850] [900] [900]
Выровненные консенсусные последовательности генов 58 рДНК класса I (55 I)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.