БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 58-65
УДК 577.3522
ИОНОФОРНАЯ АКТИВНОСТЬ УКОРОЧЕННОГО АНАЛОГА ГРАМИЦИДИНА А В ФОСФОЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ И МЕМБРАНАХ МИТОХОНДРИЙ И ЭРИТРОЦИТОВ
© 2008 г. Е. А. Дуцева1'2, Е. А. Котова1, Ю. Н. Антоненко1*
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (095)939-31-81; электронная почта: antonen@genebee.msu.ru;
2Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Поступила в редакцию 16.07.2007 г.
Изучена ионофорная активность укороченного с N-конца аналога грамицидина А, называемого мини-грамицидином, и его ковалентного димера на плоских бислойных липидных мембранах (БЛМ) как при больших концентрациях пептидов (измерение интегрального тока), так и на уровне одиночных каналов. Показано, что интегральный ток, индуцированный через БЛМ мини-грамицидином, подвергается сенсибилизированной фотоинактивации, т.е. подавляется при освещении БЛМ в присутствии фотосенсибилизатора, генерирующего синглетный кислород, подобно току, индуцированному грамицидином А, причем фоточувствительность убывает в ряду: мини-грамицидин димер, мини-грамицидин мономер, грамицидин А. Анализ кинетических кривых фотосенсибилизированной инактивации, вызванной одиночными вспышками света, при различных уровнях интегрального тока, наряду с измерениями одиночных каналов, позволил сделать вывод о существовании нескольких проводящих форм мини-грамицидина и его ковалентного димера, соотношение между которыми, по-видимому, определяется толщиной фосфолипидной мембраны. Изучение действия пептидов на природные мембраны (митохондрий и эритроцитов) показало, что ионофорная активность мини-грамицидина и его ковалентного димера существенно зависит от вида мембраны.
Изучение взаимодействия пептидов с искусственными мембранами представляет большой интерес для понимания работы мембранных белков в клетках, в том числе, механизмов функционирования ионных каналов. В модельных системах наиболее изучен ионный канал, образуемый грамицидином Ä [1], который продуцируется Bacillus brevis. Этот пентадекапептид формирует в липид-ной мембране спиральную структуру в виде димера "голова к голове", при этом образуется ионный канал, селективный к одновалентным катионам [2]. Большой объем данных о грамицидине Ä получен методом регистрации одиночных каналов в БЛМ [3]. В последние годы значительную информацию о кинетических свойствах грамицидиновых каналов удалось получить с помощью разработанного в нашей лаборатории метода фотосенсибилизированной инактивации [4]. Изучение структурно-функциональных свойств грамицидина Ä позволило существенно продвинуться в понимании влияния мембраны на конформацию и свойства
Сокращения: БЛМ - бислойная липидная мембрана, Л1Ре8з -трижды сульфированный фталоцианин алюминия, БРИРС - ди-фитаноилфосфатидилхолин, РОРС - пальмитоилолеоилфос-фатидилхолин.
*Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ионных каналов. В частности, была выдвинута концепция о зависимости свойств канала от соотношения между толщиной мембраны и длиной канала [5].
Значительный интерес представляют аналоги грамицидина А, у которых изменено число как С-, так и К-концевых аминокислотных остатков. В лаборатории У. Керта синтезирован аналог грамицидина А, укороченный на четыре аминокислоты с К-конца (таблица), который получил название мини-грамицидина [6]. В органических растворителях этот пептид принимал как форму классических грамицидиновых каналов (димер голова к голове), так и форму двойной спирали [7]. Показано, что ионофорная активность мини-грамицидина существенно зависит от толщины мембраны, однако природа его проводящих форм остается неясной. В настоящей работе проведено систематическое исследование механизма работы мини-грамицидина и его ковалентного димера как на БЛМ, так и на липосомах, митохондриях и эритроцитах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Мини-грамицидин и димер мини-грамицидина синтезированы в лаборатории У. Керта согласно
Пептиды, используемые в работе
Пептид Аминокислотная последовательность
Грамицидин A HCO-L-Vai-G-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OH
Мини-грамицидин HCO-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OSi(tBu)Ph2
Ковалентный димер мини-грамицидина O с _ L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OSi(tBu)Ph2 L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-
// O NHCH2CH2OSi(tBu)Ph2
[6] (таблица). В работе использовали грамицидин А фирмы "Sigma" (США), липиды фирмы "Avanti Polar Lipids" (США), AlPcS3 "Porphyrine Products" (США). БЛМ формировали из 2% раствора липида в растворителе по методике Мюллера [8] на отверстии диаметром 0.5 мм в тефлоновой перегородке, разделяющей две водные фазы, содержащие 1 М KCl (или 0.1 М KCl), 10 мМ MES, 10 мМ трис, 10 мМ Р-аланин, pH 7. Растворы пептидов в большинстве случаев добавляли с цис-стороны мембраны (цис-стороной условно называем сторону ячейки, к которой прикладывается положительный потенциал и с которой производится освещение мембраны). При измерении проводимости мембраны применяли хлорсеребряные электроды, которые погружали непосредственно в ячейку. Электрический ток через мембрану измеряли с помощью усилителя Keithley 428. Аналоговый сигнал передавали в компьютер при помощи платы LabPC 1200 ("National Instruments, Inc.", США) и анализировали с помощью программы WinWCP Strathclyde Electrophysiol-ogy Software, разработанной Джоном Демпстером. Для освещения мембраны постоянным светом использовали лампу накаливания с мощностью излучения вблизи мембраны 30 мВт/см2. Вспышку света получали с помощью ксеноновой лампы-вспышки, энергия излучения которой составляла 400 мДж/см2, а длительность была менее 3 мс.
Для характеристики ионных каналов мини-грамицидина наряду с анализом одиночных каналов, которые регистрируются при низких концентрациях пептидов, мы применяли разработанный в нашей лаборатории метод фотосенсибилизирован-ной инактивации. Этот метод основан на том, что освещение БЛМ видимым светом в присутствии фотосенсибилизатора приводит к фотоинактивации грамицидиновых каналов, а именно к падению индуцированного тока через БЛМ [9-12], причем чувствительность к фотосенсибилизированной инактивации определяется наличием в молекуле грамицидина А четырех триптофановых остатков [13]. Поскольку в молекуле мини-грамицидина сохранены все триптофановые остатки, следовало
ожидать, что он также обладает фоточувствительностью.
Электрический потенциал на мембранах липо-сом измеряли по флуоресценции красителя сафранина О по методу, описанному в работе [14]. Моно-ламеллярные липосомы из яичного фосфатидил-холина ("Avanti Polar Lipids") приготавливали в растворе 5 мМ фосфатного буфера и 200 мМ KCl, pH 7 с помощью экструдера ("Avanti Polar Lipids") с фильтром, размеры пор которого составляли 0.1 мкм. Липосомы в концентрации 0.2 мг/мл суспендировали в бескалиевой среде, содержащей 340 мМ сахарозы, 10 мМ трис, 10 мМ MES, pH 7, в присутствии 1 мкМ сафранина О. Краситель возбуждали при 520 нм, флуоресценцию регистрировали при 580 нм. Измерения проводили на спек-трофлуориметре Панорама флюорат-02 фирмы "Люмекс" (Москва). Относительные изменения мембранного потенциала оценивали по изменению интенсивности флуоресценции сафранина О согласно формуле (F - F0)/F0, где F - интенсивность флуоресценции сафранина в присутствии грамицидина, F0 - интенсивность флуоресценции сафранина в присутствии липосом.
Митохондрии печени крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования по стандартной методике. Среда выделения содержала 300 сахарозы, 10 мМ MOPS, 1 мМ EDTA, pH 7.4. Измерения проводили в буферном растворе, содержащем 10 мМ KCl, 70 мМ сахарозы, 190 мМ маннитола, 20 мМ HEPES, 5 мМ сукцината, 0.5 мМ EDTA, pH 7.5. Концентрация сафранина О -10 мкМ; митохондрий в кювете - около 1 мг/мл.
Эритроциты выделяли из крови доноров путем центрифугирования в среде, содержащей 10 мМ трис, 140 мМ NaCl, 0.2 мМ EDTA, рН 7.4. Мембранный потенциал эритроцитов определяли по изменению флуоресценции сафранина О (10 мкМ) при 580 нм. Среда измерения содержала 150 мМ холин-хлорида, 10 мМ HEPES, pH 7. Добавка эритроцитов приводила к возрастанию поглощения в ячей-
I/Io, % 120
100 80 60 40 20
0 120 100 80 60 40 20
250 t, с
I/I0, 105 %
100
95 -
90 -
85 -
80 -
75 |
0
101 100 99 Л
98 -
97 -
96 -
95 |
10
t, с
0
5
10
15 t, с
100 120 140 t, с
Рис. 1. Сравнение фоточувствительности мини-грамицидина и его ковалентного димера в присутствии фотосенсибилизатора. Спад индуцируемого мини-грамицидином (1) и его ковалентным димером (2) тока через БЛМ при освещении мощной лампой (а) и при использовании лампы в 200 раз меньшей мощности (•) в присутствии 1 мкМ AIPCS3. Напряжение на мембране -30 мВ. Измерения проводили в растворе 1 М KCl, 10 мМ MES, 10 мМ трис, pH 7. Мембрана сформирована из раствора DPhPC в сквалене (20 мг/мл).
ке на 0.8 опт. ед. при 650 нм (измерения проводили на спектрофотометре Amersham Ultraspec 1100).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 приведены кривые фотосенсибилизи-рованной инактивации пептида мини-грамицидина (кривая 1) и его ковалентного димера (кривая 2) постоянным светом. Оба пептида проявляли выраженную фоточувствительность в присутствии фотосенсибилизатора (AlPcS3), однако в случае ковалентного димера быстрый спад тока завершался разрывом мембраны (рис. 1а). При освещении лампой меньшей мощности в случае димера мини-грамицидина наблюдался спад тока без разрыва мембраны (рис. 16). Фоточувствительность мономера мини-грамицидина в этих условиях была вы-
Рис. 2. Кинетика подавления тока, индуцированного мини-грамицидином (а) и грамицидином А (•), в ответ на вспышку света в нулевой момент времени в присутствии 1 мкМ AIPCS3 в транс-отделении ячейки. Начальное значение тока - около 0.1 мкА. Потенциал на БЛМ - 30 мВ. Измерения проводили в растворе 1 М KCl,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.