БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 3, с. 230-237
УДК 577.112
ИОНЫ Ca2+ МОДУЛИРУЮТ УРОВЕНЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ/ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ КУКУРУЗЫ
© 2013 г. И. Ю. Субота*, А. Ш. Арзиев, М. В. Кулинченко, Ю. М. Константинов
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317;
*электронная почта: subota@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 08.11.2012 г.
Исследовано фосфорилирование/дефосфорилирование митохондриальных белков в присутствии ионов кальция в концентрации, вызывающей открытие Са2+-зависимой и CsA-чувствительной неселективной поры. Выявлен различный характер данной посттрансляционной модификации белков митохондрий в системах in organello и in vivo при краткосрочном (30 мин) и долговременном (20 ч) действии ионов Са2+. Показано, что ионы Са2+ в концентрации 2 мМ индуцировали набухание митохондрий, обусловленное открытием неселективной циклоспорин-чувствительной поры. С помощью метода фосфорилирования белков in organello показано, что обработка CaCl2 (2 мМ) вызывала увеличение уровня фосфорилирования белков с молекулярной массой около 74, 61, 60 и 33 кДа. Однако фосфорилирование белков ~51.5 и 37 кДа в этих условиях было снижено по сравнению с контролем. В присутствии ионов Са2+ в изолированных митохондриях дополнительно фосфорилиро-вались полипептиды 66 кДа (полипептид, определенный нами ранее как БТШ60) и 57 кДа (а-субъ-единица Б^комплекса АТР-азы). Данный факт указывает на то, что митохондрии кукурузы содержат по крайней мере одну Са2+-зависимую протеинкиназу. Обнаружено, что при действии ионов кальция изменяется уровень фосфорилирования субъединиц Б^АТР-азы, но не изменяется их синтез. Последнее касается как белков, кодируемых ядром ф-субъединица Б^АТР-азы), так и митохондриями (а-субъединица Б^АТР-азы). Полученные нами данные об увеличении уровня фосфорилирования отдельных митохондриальных белков кукурузы под влиянием ионов кальция в концентрации, вызывающей открытие неселективной поры и выход цитохрома с, свидетельствуют о тонкой регуляции ответа растительных митохондрий на абиотический стресс.
Ключевые слова: митохондрии, фосфорилирование/дефосфорилирование белков, ионы Са2+, ша-пероны.
Б01: 10.7868/80233475513030092
Митохондрии — динамично изменяющиеся органеллы, которые выполняют ряд жизненно важных функций в эукариотической клетке. Помимо участия в энергетическом метаболизме митохондрии вовлечены в ряд процессов промежуточного метаболизма, передачи кальциевого сигнала, редокс-регуляции и апоптоза [1, 2]. Все это требует сложной системы внутриклеточной передачи сигнала, способной быстро отвечать на изменения в клеточном метаболизме. Все возможные механизмы метаболического контроля дыхания митохондрий можно разделить на два больших класса на основе временного интервала, необходимого для изменения скорости работы
Сокращения: БТШ — белки теплового шока, тРТР-пора — митохондриальная пора неселективной проницаемости; СССР — хлоркарбонилцианидфенилгидразон, С8Д — циклоспорин А; ПААГ — полиакриламидный гель; SDS — до-децилсульфат натрия.
фермента. Эти механизмы, согласно [3], называют механизмами "грубого метаболического контроля" и "тонкого метаболического контроля".
Грубый контроль — это длительный энергозатратный ответ, который реализуется через изменения в общей клеточной популяции молекул фермента. В связи с этим любое изменение в уровне экспрессии соответствующих генов (транскрипции, трансляции, процессинга или деградации мРНК), или протеолиз могут рассматриваться как грубый метаболический контроль [3]. Тонкий контроль функционирует как "метаболический трансдуктор", который воспринимает сиюминутные требования клетки и обеспечивает соответствующий этим требованиями уровень потока метаболитов через сигнальные пути. Регуляция ферментов за счет обратимых ковалентных модификаций играет главную роль в тонком метаболическом контроле. Очевидно, что у высших эу-
кариот, включая растения, наиболее распространенными видами обратимых ковалентных модификаций белков являются фосфорилирование/ дефосфорилирование и тиол-дисульфидный обмен [4—6]. Показано, что фосфорилирование/де-фосфорилирование белков играет существенную роль в регуляции многих ферментов, вовлеченных в дыхательный метаболизм у животных [3, 4, 7]. По крайней мере, семь митохондриальных ферментов, связанных с дыханием растений, контролируется, хотя бы частично, с помощью фосфори-лирования. В настоящее время в митохондриях арабидопсиса и гороха идентифицировано более 10 протеинкиназ и одна протеинфосфатаза [8]. Согласно анализу т зШев в среднем в митохондриях растений содержится от 50 до 200 протеинкиназ, столько же или больше белков-мишеней и 10—30 протеинфосфатаз [9].
Обратимые ковалентные модификации ферментов очень чувствительны к сигналам. Среди внутриклеточных мессенджеров, участвующих в передаче сигнала в митохондриях, центральное место занимают очевидно ионы Са2+. Общеизвестно, что свободный кальций играет жизненно важную роль в клеточном развитии, он вовлечен в выполнение многих физиологических функций, включая апоптоз. Кальций в цитоплазму поступает через различные катионные каналы плазматической мембраны из внеклеточного пространства. Концентрация свободного Са2+ в цитоплазме много ниже, чем с наружной стороны клетки или в некоторых Са2+-накапливающих органел-лах [10]. Низкая концентрация кальция в цитоплазме клеток растений обусловлена присутствием таких хранилищ кальция, как вакуоли, эндо-плазматический ретикулум и митохондрии.
В митохондриях, как в любом другом компарт-менте клетки, уровень Са2+ постоянно изменяется в широких пределах. Мембранный потенциал и увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий участвуют в поддержании го-меостаза Са2+ в растительных клетках. Показано, что ионы Са2+ в концентрации 1—2.5 мМ запускают в митохондриях злаков события, связанные с начальными стадиями апоптоза (в частности, высокоамплитудное набухание митохондрий) [11]. Высокоамплитудное набухание митохондрий связано с открытием неселективной поры, сопровождаемым падением мембранного потенциала митохондрий. Ранее мы показали, что митохон-дриальные протеинкиназы/протеинфосфатазы редокс-чувствительны [12]. Таким образом, при высокоамплитудном набухании митохондрий уровень фосфорилирования/дефосфорилирова-ния митохондриальных белков может изменяться, что, по-видимому, является одним из этапов ответа на стресс, вызванный высокими концентрациями ионов Са2+. В представленной работе изучено фосфорилирование/дефосфорилирова-ние митохондриальных белков в присутствии
ионов кальция в концентрации, вызывающей открытие CsA-чувствительной mPTP-поры. Выявлены различия в характере данной посттрансляционной модификации белков митохондрий в системах in organello и in vivo при краткосрочном (30 мин) и длительном (20 ч) воздействии ионов Ca2+.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 4-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L., гибрид ВИР 42МВ).
Получение митохондрий. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности сахарозы [13].
Набухание митохондрий определяли с помощью спектрофотометра SmartSpecPlus (Bio-Rad, США) при 540 нм [14]. Набухание измеряли при 25°С в инкубационной среде (1 мл) следующего состава: 0.25 М сахарозы, 10 мкМ EGTA, 10 мМ HEPES (pH 7.4) и 0.2 мг митохондриального белка. Кинетику набухания снимали в течение 30 мин.
Для определения выхода белков из митохондрий
после измерения оптической плотности каждый образец центрифугировали при 12000 g в течение 14 мин. Отбирали супернатант, содержащий вышедшие из митохондрий полипептиды. Белки осаждали холодным ацетоном (50% v/v) и оставляли на ночь при —20°С. Затем пробы центрифугировали и отмывали дважды 100% ацетоном и 2 раза 80% ацетоном. Пробы сушили и разводили в SDS-буфере для образцов (50 мМ трис-HCl, pH 8.5, 2% SDS, 2% 2-меркаптоэтанол, 20% глицерин, 0.05% бромфеноловый синий).
Фосфорилирование белков in vitro проводили согласно [15]. Осадок митохондрий ресуспендиро-вали в 50 мкл буфера, содержавшего 0.3 М сахарозу, 50 мМ HEPES (pH 7.4), 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ CaCl2 и 0.2 мМ (0.4-1.0 Ки/ммоль) [у-32Р]АТР (ФГУП "ИРМ", Россия). Инкубацию проводили в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали, добавляя буфер для образцов. Смесь прогревали при температуре 100°С в течение 2 мин. Полученные пробы хранили при температуре -20°С.
Полипептидный состав фосфорилированных белков анализировали как в работе [16]. Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ в присутствии SDS. Гели окрашивали в течение 60 мин 0.2% раствором Comassie R-250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте. Для обесцвечивания фона гель переносили в раствор, содержавший 10% уксусную кислоту и 12% изопропанол, после чего высушивали на стеклянной подложке под слоем бумаги Whatman 3ММ. Гель экспонировали с рентгеновской пленкой марки Kodak не менее 7 дней.
232
СУБОТА и др.
^540, ОЕ
1.4
1.0'
0.6
0.2
- 3
1 1 1 1 1
10 20 30 40 50 Время, мин
Рис. 1. Са2+-индуцируемое набухание митохондрий, полученных из этиолированных проростков кукурузы. 1 — Контроль; 2 — обработка СаС12 (0.5 мМ); 3 — обработка СаС12 (2 мМ).
A, ОЕ 3.41
3.37 3.33
0
12
18
24 30 Время, мин
Рис. 2. Действие циклоспорина А на Са2+-индуциру-емое набухание митохондрий, полученных из этиолированных проростков кукурузы. 1 — Обработка СаС12 (2 мМ); 2 - обработка СаС12 (2 мМ) + циклоспорин А.
Вестерн-блот-анализ проводили согласно методике [17]. Митохондриальные белки после разделения в SDS—ПААГ переносили на нитроцел-люлозную мембрану и инкубировали в растворе первичных антител против ATP-a, АТР-р, Cyt c и Hsp70 (1 : 1000). Иммунореактивные группы выявляли с помощью вторичных антител, конъюги-рованных со щелочной фосфатазой. В работе использовали поликлональные антитела против ATP-a, АТР-р, Cyt c и Hsp70 (Agrisera, США).
BN-ПААГ (нативный голубой электрофорез). BN-ПААГ проводили согласно [18]. В качестве агента для солюбилизации митохондриальных мембран использовали буфер, содержащий
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.