научная статья по теме ИСКУССТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ КАРБАРИЛА, СОЗДАННЫЕ НА ОСНОВЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ВАРИАБЕЛЬНОГО ФРАГМЕНТА (SCFV): ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИГЕНОМ Химия

Текст научной статьи на тему «ИСКУССТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ КАРБАРИЛА, СОЗДАННЫЕ НА ОСНОВЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ВАРИАБЕЛЬНОГО ФРАГМЕНТА (SCFV): ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИГЕНОМ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1262 - 1271

УДК 577.27

ИСКУССТВЕННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ КАРБАРИЛА,

СОЗДАННЫЕ НА ОСНОВЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ВАРИАБЕЛЬНОГО ФРАГМЕНТА (scFv): ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИГЕНОМ

© 2015 Женг Ксиюан1*, Хуанг Жихонг1, Венг Ликсиа1, Лиу Ксяонан2

1 Heibei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China;

E-mail: zhangxiuyuan917@163.com 2 Tianjin University, Tianjin 300457, China

Поступила в редакцию 20.11.14 После доработки 12.03.15

Карбарил — инсектицид (низкомолекулярное соединение), ингибирующий холинэстеразу насекомых. Присутствие остаточного количества карбарила в пище и окружающей среде наносит вред здоровью людей. Высокоспецифические scFv мини-антитела, с помощью которых можно было бы идентифицировать карбарил, пока не созданы. В представленной работе сконструировали ген, кодирующий антикарбариловые scFv мини-антитела. Предварительно были клонированы гены VL и VH, кодирующие вариабельные районы молекул иммуноглобулинов, из генома гибридных клеток (гибридом) мышей, секретирующих моноклональные антитела против карбарила. Далее эти гены были объединены между собой ПЦР методом сплайсинга перекрывающимися расширениями (SOE (splicing by overlap ех!ешюп)-ПЦР) последовательностью, кодирующей гибкий олигопептидный линкер (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. Сконструированная после этого рекомбинант-ная плазмида (scFv-pET-26b) была экспрессирована в клетках E. coli BL21. Экспрессию рекомбинантного белка проверяли методом Ds-Na-ПААГ электрофореза и иммуноферментного анализа (ИФА). Построена компьютерная модель трехмерной структуры антикарбарил scFv мини-антитела, и путем молекулярного до-кинга была смоделирована структура комплекса карбарила с мини-антителом. При анализе модели установлено, что карбарил-связывающий участок образован следующими аминокислотными остатками: Ala51, Ser52, Ile51, Gly54, Ser56, Arg98 и Gly100. Дальнейшее изучение этой модели может помочь установлению механизма взаимодействия карбарила с его специфическими антителами. Кроме того, эта модель может служить целям in vitro повышения аффинности антител к карбарилу.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: карбарил, антикарбарил scFv мини-анитела, ИФА, комплекс антиген—антитело.

Карбарил (С12ИП 1-нафтил-М-метил-

карбамат) (рис. 1) — это инсектицид карбамат-ной природы контактного и желудочного действия, оказывающий также системное воздействие на зерновые и древесные культуры. Подобно фосфорорганическим соединениям, карбарил обратимо ингибирует холинестеразу насекомых [1]. У высших животных он вызывает появление типичных симптомов отравления: усиление слезотечения и слюноотделения, ми-оз, в тяжелых случаях судороги и смерть [2]. Остаточные количества карбарила в пище и окружающей среде могут представлять опасность для человека.

В течение последних лет большое внимание уделяется мониторингу карбарила в пище, поч-

* Адресат для корреспонденции.

ве и т.д. Законодательством Евросоюза (директива 396/2005) установлено требование к максимальному уровню остаточного карбарила в пищевых продуктах — 0,05 мг/кг [3]. Для специфического тестирования этого инсектицида требуется чувствительный метод с простой и быстрой процедурой определения. Существующие общеупотребительные методы основаны на хрома-тографическом или спектрофотометрическом определении предварительно модифицированного карбарила путем ТСХ или ЖХВД [4]. Для выполнения анализа этими методами требуется длительная процедура подготовки образцов и наличие специализированного лабораторного оборудования. В настоящее время все большую популярность завоевывает метод иммунофер-ментного анализа (ИФА), позволяющий выполнять экспресс-тестирование большого количе-

Рис. 1. Структурная формула молекулы карбарила

ства образцов с высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения [5].

Мини-антитела на основе одноцепочечного вариабельного фрагмента ^сБу) относятся к антителам третьего поколения. В последние годы появилась возможность получать 8сРу мини-антитела с использованием ДНК-гибридизацион-ной технологии и продуцировать эти рекомби-нантные белки в бактериальной культуре. Стоимость производства таких искусственных антител значительно ниже, чем стоимость поликло-нальных или моноклональных. Кроме того, 8сРу могут быть получены большими партиями и эффективно конъюгированы с маркерными молекулами для иммунологического тестирования [6]. В соответствии с этим, одной из целей нашей работы явилось конструирование высокоаффинного миниантитела 8сБу против карбари-ла и подтверждение его специфического детектирования.

Аффинность 8сБу мини-антител по отношению к низкомолекулярным антигенам обычно бывает более низкой, чем к макромолекулам. Изучение механизмов связывания 8сБу с антигенами могло бы помочь выяснить причины этого и увеличить аффинитет мини-антител. Сейчас механизм связывания антигена с антителом изучен мало, поэтому конструирование гап-тенов для получения антител сопровождается массой проб и ошибок и представляет значи-

тельные трудности. Обычно связывание белка и лиганда изучается на основании данных о кристаллической структуре комплекса белок—лиганд и занимает много времени и сил. Поэтому другой целью нашего исследования явилось конструирование с помощью биоинформационных подходов виртуальной модели комплекса 8сБу мини-антитело—карбарил, изучение которой могло бы помочь в будущем увеличению аффинитета антител к карбарилу.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки, материалы и реактивы. Использовали плазмиды PGEM-T-Easyа («Pramega», США), pET-26b («Beijing Bao Covey food safety Biological Technology», Китай) и культуру Escherichia coli линии JM109 («TaKaRa Biotechnology», Китай). Олигонуклеотидные праймеры ([7] и табл. 1) синтезированы фирмой «Invitrogen» (США). Рестриктазы EcoRI и XhoI — фирмы «TaKaRa» (Китай), ДНК полимераза Pfu ДНК и лигаза T4 — «TransGen Biotechnology» (Китай). Использовали набор для обратной транскрипции GoScript reveree transcription system фирмы «Promega» (США), наборы DNA gel extraction kit, RNeasy Midi kit, Oligotex mRNA Mini Kit и QIA quick PCR Purification Kit — фирмы «Qiagen» (США). Клон гибридных клеток, продуцирующих мо-ноклональные антитела против карбарила, был ранее получен в нашей лаборатории. Все химические реагенты были аналитической чистоты. ПЦР выполняли с помощью прибора DNA Engine thernal cycles а анализ гелей и фотопленок проводили на системе Gel Doc XR (все «BioRad», США).

Экстракция РНК. Суммарную фракцию РНК экстрагировали из гибридных клеток-продуцентов моноклональных антител (из ~106—107 клеток) с использованием набора RNeasy Midi kit в соответствии с инструкцией производителя («Qiagen», США).

Клонирование генов VL и VH. Синтез кДНК из РНК осуществляли путем обратной транскрипции и ПЦР с использованием соответствующего набора реагентов для ОТ-ПЦР. Эта кДНК служила матрицей для амплификации генных последовательностей VL и VH, кодирующих вариабельные районы обоих цепей Ig; ПЦР выполняли с использованием соответствующих прямых и обратных праймеров (VL-back, VL-^эг-wará и VH-back, VH^o^a^). Режим проведения ПЦР: начальная денатурация 95° 5 мин, затем 35 циклов при 95° по 1 мин, далее 53° в течение 1 мин и 72° по 1 мин, наконец, 72° в течение 10 мин. Продукты ПЦР были очищены электро-

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при клонировании и получении искусственного гена, кодирующего веБу

Название праймера Олигонуклеотид

VH-Back AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG

VH-For TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC

VK-Back GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA

MJK1-FONX CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC

MJK2-FONX CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC

MJK4-FONX CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC

MJK5-FONX CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC

VH-Back-EcoRI TACTCAGAATTCGCAGGTCCAACTGCAGGAGTC

VL-For-XhoI TACTCACTCGAGCCGTTTTATTTCCAGCTTGGT

Линкер GGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTG-GCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA

Примечание. Подчеркнуты участки рестрикции ЕеоВ! и Хко\; 8, М, R и W — вырожденные основания, означающие (в, С), (А, С), (А, в) и (А, Т) соответственно.

форезом в агарозном геле с использованием набора agarose gel DNA purification kit.

Конструирование гена scFv методом SOE (сплайсинг перекрывающимися расширениями)-

ПЦР. Полученные (как описано выше) фрагменты ДНК, соответствующие генам VH и VL, были объединены путем SOE-ПЦР с целью создания искусственного гена scFv. Фрагмент VL был использован в качестве матрицы для амплификации последовательности, несущей ген VL, участок рестрикции XhoI и часть последовательности, кодирующей олигопептидный линкер; амплификацию проводили в отсутствие прай-меров VL-For-Xhol и VL-back-linker. Фрагмент VH служил матрицей для амплификации последовательности, составленной геном VH, участком рестрикции EcoRI и другой частью последовательности олигопептидного линкера; амплификацию проводили в отсутствие праймеров VH-Back-EcoRI и VH-forward-linker. ПЦР выполняли в режиме, описанном выше. Полученные в результате амплификации последовательности были затем объединены путем SOE-ПЦР в единый ген scFv, в котором фрагменты VH и VL соединены между собой генной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер (Gly4—Ser)3. SOE-ПЦР проводили в следующем режиме: начальная денатурация при 94° 5 мин, затем 10 циклов при 94° 45 с, 50° 1 мин, 72° 1 мин и, наконец, 72° 10 мин. После этого

амплифицировали ген scFv, несущий участки EcoRI и XhoI; амплификация была проведена с использованием праймеров VL-For-XhoI и VH-Back-EcoRI в соответствии с приведенным выше протоколом для ПЦР генов VL и VH. Продукты амплификации были очищены электрофорезом в агарозном геле с использованием набора для очистки ДНК (agarose gel DNA purification kit) [8, 9].

Конструирование рекомбинантной плазмиды pET-26b-scFv. Генная последовательность scFv, описанная выше, была расщеплена по соответствующим участкам рестриктазами EcoRI и XhoI и встроена в плазмиду pET-26b. Рекомбинант-ная плазмида была трансфицирована в компетентные клетки E. coli JM109. Колонии трансформированных клеток были выявлены с помощью ПЦР. Рестрикционный анализ плазмид из позитивных колоний и генное секвенировани

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком