БИСОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 20 * № 1 * 1994
УДК 577.113.4.083.3
© 1994 В. И. Киселева, М. Ф. Турчинский % Т. Б. Колесник % А. М. Поверенный
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИЭТИЛЕНТРИАМИНХЛОРПЛАТИНЫ В ГИБРИДИЗАЦИОННОМ АНАЛИЗЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск;
'Институт биоорганической химии им. M. М. Шемякина и Ю, А. Овчинникова РАН, Москва
Диэтилентриаминхлорплатину предложено использовать в гиб р ид и з а ц и он н о м анализе специфических нуклеотидных последовательностей для мечения ДНК-зонда, а высокоаффинные антитела к комплексу ДНК— Pt (dien) — для детекции ДНК : ДНК-гибридов. Процедура мечения чрезвычайно проста и включает только смешивание растворов реагентов и инкубацию их в течение 2 ч при 60° С. Чувствительности и специфичности метода достаточно, чтобы тестировать 8 фг ДНК б условиях точечной гибридизации.
В предыдущих работах нами был предложен метод гибридизационного анализа специфических нуклеотидных последовательностей с использованием в качестве метки для гибридизационного зонда аддукта ¿/vms-DDP, а для визуализации полученных гибридов ■— аффинных антител к ДНК-irartÄ-DDP [1—4]. Достоинством этого метода является чрезвычайная простота процедуры мечения зонда и высокая аффинность антител, определяющая высокую чувствительность системы иммуноферментной детекции. Метод позволяет определять 8-10" 13 г ДНК в Саузерн-блот-гибридизации.
В настоящей работе для мечения гибридизационных зондов предложено использовать другой аминокомплекс двухвалентной платины — [Pt(dien)Cl]Cl. Взаимодействие его с ДНК так же. как и в случае с другими аминопроизводными платины — eis-DDP и trans-DDP, происходит легко, в мягких условиях (инкубация ДНК и Pî-комплексов в 0,01 M NaC104 в течение 48 ч при комнатной температуре в темноте приводит к количественному связыванию реагентов [5— 7] ), с образованием прочных координационных связей.
Антитела к модифицированной ДНК ( flHK-Pt(dien)) были получены принципиально по той же методике, что была описана нами ранее для антител к ДНК-Zrans-DDP f 2, 4]. Иммунные сыворотки и выделенные из них аффинные антитела анализировали методом прямого и конкурентного ИФА на полистироло-
* Сокращения: BS А — бычий сывороточный альбумин, SDS — додецилсульфат Na, ПЭГ — полиэтиленгликоль, EDTA — этилендиаминтетрауксусная кислота, dien — диэтилентриамин, [Pt(dien)Cl]Cl — хлорид диэтилентриаминхлорплатины (II), flHK-Pt(dien) - аддукт fPt(dien)Cl]Cl с ДИК, Irans-DDP — трапс-цаамминдихлорплатина, га — молярное соотношение Pt/нуклеотид в реакционной смеси, ги — молярное соотношение Pt/нуклеотид в препарате ДНК-Р1(й1еп), ИФА — иммуноферментный анализ, ICso— концентрация ингибитора, вызывающая 50%-иое подавление связывания антител с антигеном, иммобилизованным на полистироловой планшете.
Рис. 1. Конкурентное ингибированме в ИФА связывания антител к ДНК Pt{ liien) с антигеном аддук-том ДНК- РК dien), rb 0,1 ( /),
-IS -13 -11 3 -7 5
log/' ингибитор) / М
вых планшетах. В результате установлено, что в прямей реакции достаточно интенсивная цветная окраска развивается в течение 30 мин при использовании; антисывороток в разведении 1/200 000 (данные ле приводятся). Такой высокий титр косвенно свидетельствует о высокой аффинности антител к ДНК Pt(dien). Об этом говорит также крутой наклон кривых ингибирования связывающей активности антител антигеном (рис. I), Из результатов, представленных на рис. 1, следует, что антитела к ДНК-Р1( dien) высокоспецифичны, они не взаимодействуют с ^модифицированными ДНК, ни с нативной, ни с денатурированной, взятыми в концентрации, в Ю6 раз превышающей концентрацию модифицированной ДНК. Кз рис. 1 следует также, что ДНК-Рт( dien), денатурированная кипячение;/, узнается антителами лучше, чем неденатурированный аддукт. Очевидно, термическая обработка такой модифицированной ДНК не приводит к разрушению антигенной детерминанты, т. е. комплекс достаточно стабилен. А одной из причин несколько лучшего распознавания ее антитс.и после денатурации может являться увеличение доступности эпитопа. Следует отметить, что, по данным УФ-спектрометрии, модификация ДНК комплексом ) Pt( dien) Clj CI вплоть до rb 0,1 практически не сказывается на кинетике ее термической денатурации — ренатурации, а также не влияет на гиперхромный эффект, вызываемый щелочной денатурацией[8].
Одной из основных особенностей комплекса [ Pt( dien) CI] С1 является то, что он образует с ДНК только монофункциональные соединения. Взаимодействие [ Ptf dien) Ci] С1 с ДИК до значения гь, не превышающего 0,1, происходит по N7 гуанина. Выше этого уровня связывание может происходить также по N" аденина [ 6]. Платинирование пурина в ^-положение в отличие от ал кодирования стабилизирует N-гликозидиую связь и имидазольное кольцо и практически не вызывает изменения вторичной структуры ДНК, не нарушает стэкинг-взаимо-действия между парами оснований [ 6—9].
Скорость образования монофункциональных аддуктоь ДНК с Pi-комплексами гораздо выше, чем бифункциональных. Так, в случае с trans-DDP, которая образует как моно-, так и бизамещенные соединения, до 85% trän «--DDP взаимодействует с ДНК одной своей валентностью в течение 1 ч инкубации [ 10] и затем происходит медленный переход к бифункциональным аддуктам, который завершается через 2 сут инкубации в 0,01 М NaCl04 при 28° С [5]. А поскольку [ Pt( dien) CI] С1 образует с ДНК только монофункциональные аддукты, логично полагать, что время модификации ДНК [ Pt( dien) Ci] CA по строению с trans-DDP можно сократить, повысив температуру реакции. Образцы ДНК, полученные при
Анализ аффинности антител к ДНК-И( dien), полученным в различных условиях (га 0,1) и подвергнутым различным последующим обработкам
Условия модификации [ Pt( dien) Cl] Cl ДНК Условия последующей обработки ДНК-Pt(dien) * 1С50.ЮП, м
t, °C Время, ч
37 48 _ 1,1
А 4,3
60 0,5 — 8,1
1 — 5,0
2 — 1,4
3 — 0,99
4 Л — 1,3
16 — 1,1
37 48 Б 1,2
60 2 Б 1,3
' * А — кипячение (100° С, 10 мин), Б — инкубация в гибридизациояном буфере (65° С, 16—18 ч).
60° С в таких условиях в течение разных промежутков времени (0,5—4,0 ч), анализировали по тесту конкурентного ИФА. В качестве контроля служила ДНК-Pt(dien), модифицированная в течение 48 ч при 37° С (условия, в которых, как известно, происходит полное взаимодействие Pt-комнлексов с ДНК [5—7]). Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что в этих условиях модификация практически завершается через 1,5—2,0 ч.
В таблице приведены также результаты ИФА-анализа ДНК-Р^ dien), преинкубированной в гибридизационном буфере в течение 16—18 ч. Очевидно, что такая обработка не влияет на способность модифицированной ДНК взаимодействовать с соответствующими антителами, т. е. комплекс ДНК—Pt(dien) сохраняет свою стабильность в условиях гибридизации.
Для оценки эффективности использования [ Pt( dien) Cl] С1 в качестве метки для нуклеотидного зонда и выбора оптимального уровня модификации была проведена серия модельных экспериментов по точечной гибридизации ДНК фага X, иммобилизованной на нитроцеллюлозных мембранах ВА-85, с ДНК с разной степенью модификации (гь 0,03—0,20). Одновременно были испытаны и разные условия получения модифицированного зонда (см. «Эксперимент, часть»). В результате установлено, что увеличение степени модификации зонда до 10% (га 0,1) приводит к усилению гибридизационного сигнала (рис. 2). Дальнейшее повышение степени модификации до 20% не вызывает сколько-нибудь заметного изменения этого сигнала (данные не приводятся). При этом гибридизация и последующая иммуноферментная детекция гибридов происходят в равной степени эффективно при использовании зондов, модифицированных [ Pt( dien) Cl] CI как в течение 48 ч при 37° С, так и в течение 2 ч при 60° С. В том и другом случаях на доте легко определяется Ю-14 г ДНК.
В качестве отрицательного контроля на мембранах иммобилизовали ДНК тимуса теленка. Из рис. 2 видно, что 10"8 г гетерологичной ДНК дают сигнал по интенсивности примерно такой же, как и 10~14 г гомологичной ДНК, что свидетельствует о высокой специфичности предлагаемого метода.
Предложенный метод гибридизационного анализа был апробирован в реальной системе для скрининга библиотеки кДНК, обогащенной фрагментами 19-й хромосомы человека. На рис. 3 представлены результаты гибридизации модифицированных [Pt(dien)CI]Cl ДНК-зондов (размер зондов — 0,25—1,00 тыс.
Рис. 2. Точечная гибридизация ДНК л (А) и ДНК тимуса теленка ( В), иммобилизованных на ннтро-целлюлозных мембранах, с ДНК X, модифицированной [Pt(dien)CI]Cl в различных условиях. Количество иммобилизованной на мембране ДНК (А): 1 иг (/), 100 (2), 10 (3), 1 нг (4), 200 (5), 40 (б), 8 (7), 1,6 фг (S); Б: 100 (/), 10 (2),1 нг(i). Условия модификации ДНК-зонда; 2 ч при 60° С, г. 0,1 (I), 48 ч при 37° С, г., 0,1 (II), 0,05 (III) и 0,03 (IV)
12345678
А «Г* * - ■
В
12345678
А + *' *> ,:■:•
ж
в
1 2 3 4 5 6 7 8
Ж А *"# .*
1 2 3 4 5 6 7 8
Ж А * ♦
п. о.), полученных методом гибридизационного вычитания, с ДНК-мишенью, иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране. В качестве мишени были использованы два образца кДНК, один из которых (Т) содержал нуклеотидные последовательности 19-й хромосомы человека и хромосомы хомяка, а другой (D) — только хромосомы хомяка [11]. Все зонды, содержащие ДНК из гибридных клонов, должны давать и дают сигнал с (Т) h(D) (1,2,5 — рис. 3). Те зонды, которые обогащены последовательностями ДНК 19-й хромосомы человека, должны давать более интенсивный сигнал с (Т) (-/ — рис. 3). Зонды, не содержащие ДНК из гибридных клонов, не дают сигнала вообще (3 — рис. 3). Такой подход позволяет анализировать библиотеки хромосом человека и выявлять клоны, содержащие специфическую ДНК хромосом. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют о том, что чувствительности и специфичности предлагаемой системы гибридизационного анализа на основе ДНК—Pt(dien) достаточно для использования ее в этих целях.
Таким образом, в настоящей работе показана возможность использования еще одного аминопроизводного Pt — [Pt(dien
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.