ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 592-599
УДК 579.254.2,582.282.123.2,582.282.192.3,544.473:577.15
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ IV Trichoderma reesei ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА ГРИБА Pénicillium verruculosum
© 2015 г. О. В. Проскурина*, О. Г. Короткова*, А. М. Рожкова*, Е. Г. Кондратьева*, В. Ю. Матыс**, И. Н. Зоров***, А. В. Кошелев**, О. Н. Окунев**, В. А. Немашкалов**, Т. В. Бубнова**, А. П. Синицын* ***
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: olgavproskurina@gmail.com **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Т.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
Поступила в редакцию 18.03.2015 г.
Изучено влияние полисахаридмонооксигеназы (эндоглюканазы IV) гриба Trichoderma reesei на гидролиз полисахаридных субстратов целлюлазами, секретируемыми грибом Penicillium verruculosum. Показано, что внесение эндоглюканазы IV из T. reesei в комплекс ферментов гриба P. verruculosum позволяет повысить эффективность гидролиза целлюлозы на 45%.
Ключевые слова: Penicillium verruculosum, полисахарид-монооксигеназы, эндоглюканаза IV Trichoder-ma reesei, биоконверсия целлюлозы.
DOI: 10.7868/S0555109915060124
Биокаталитическая деструкция целлюлозы, входящей в состав возобновляемой растительной биомассы, является ключевым этапом процесса ее превращения в сахара и другие полезные продукты. Повышение каталитической активности препаратов целлюлаз позволяет снизить их расход на осуществление процесса ферментативной деструкции биомассы и повысить экономическую эффективность процесса получения сахаров. В связи с этим в настоящее время значительные усилия исследователей направлены на поиск новых компонентов целлюлазных ферментных препаратов, повышающих их общую активность [1—5].
Была обнаружена способность белков 61 семейства гликозилгидролаз, не обладающих выраженной гидролитической активностью, повышать ее в составе целлюлазного комплекса [5, 6]. Одной из первых была изучена гликозилгидрола-за гриба Trichoderma reesei, названная эндоглюка-назой IV (ЭГГУ), которую впервые обнаружили в 1997 г. при скрининге новых целлюлаз T. reesei [7]. Поскольку содержание ЭГ^ в комплексе секре-тируемых ферментов T. reesei было невелико, то для изучения свойств этот фермент был получен методом гетерологичной экспрессии кодирующего его гена в клетках дрожжей и идентифицирован как эндоглюканаза с очень низкой гидролитической (целлюлолитической) активностью [7]. В дальнейшем ЭГ^ была получена методом
гомологичной экспрессии в клетках T. reesei, и анализ ее свойств подтвердил полученные ранее данные [8].
В 2008 г. была определена трехмерная структура ЭГ^ T. reesei. Анализ структуры этого фермента показал, что в молекуле ЭГ^ отсутствует характерный для гликозилгидролаз каталитический центр в виде "долины" или "туннеля". Ее каталитический домен представляет собой скрученный ß-сэндвич (два антипараллельных скрученных ß-листа). В молекуле ЭГ^ был обнаружен центр связывания иона меди, лигандами которого служат Hisl, His89, Tyr176, при этом ион меди связывается с функциональной группой His1 и N-концевым аминокислотным остатком полипептидной цепи. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ряда белков этой группы показал высокую консервативность этих аминокислотных остатков, то есть металлсвязыва-ющий центр характерен для всех гликозилгидролаз 61 семейства [9].
При изучении механизма действия гликозил-гидролаз этих семейств было обнаружено, что они являются металлзависимыми монооксигена-зами [10—12]. В 2013 г. было принято решение об изменении их классификации, и в настоящее время эти ферменты относят к полисахарид-моноок-сигеназам (ПМО) [13]. Ион металла, связанный с металлсвязывающим центром ПМО, катализиру-
ет атаку молекулярным кислородом С—Н-связи целлюлозной цепи, что приводит к ее разрыву [12].
В зависимости от типа ПМО атака молекулярным кислородом может осуществляться по 1 или 4 атому углерода гликозильного звена, что приводит к образованию различных продуктов. ПМО первого типа окисляет звено целлюлозной цепи до лактона (глюконовой кислоты), а при действии ПМО второго типа образуется 4-кетоальдоза. Помимо окислителя (молекулярного кислорода) в данной реакции принимает участие восстанавливающий агент, в качестве которого могут выступать система целлобиозодегидрогеназа-целлобио-за, галловая или аскорбиновая кислоты [12].
ПМО в составе целлюлазного комплекса расщепляет целлюлозную цепь в произвольной позиции и формирует пару свободных концевых остатков, один из которых окислен. Концевые остатки атакуются целлобиогидролазами, являющимися ключевыми ферментами, гидролизую-щими целлюлозу. Окисленный концевой остаток содержит заряженную группу, что способствует разрыхлению кристаллов целлюлозы и повышению доступности целлюлозных цепей для других ферментов. Таким образом, изучение совместного действия ПМО и целлюлазного комплекса можно отнести к перспективным направлениям решения задачи повышения гидролитической активности целлюлолитических комплексов и цел-люлазных ферментных препаратов [14].
В предыдущих работах были описаны результаты изучения целлюлазного комплекса гриба PeniciШum verruculosum [15, 16]. Мицелиальный гриб P. verruculosum является продуцентом внеклеточного комплекса ферментов (целлюлаз и других карбогидраз), и может стать альтернативой промышленным продуцентам — грибам рода Trichoderma. Ранее было показано, что гидролитическая активность по отношению к нерастворимой целлюлозе ферментных препаратов на основе различных штаммов P. verruculosum превосходит активность коммерческих препаратов на основе гриба T. reesei [15, 16]. Ферментные препараты, содержащие целлюлазный комплекс гриба P. verruculosum, гидролитическая активность которых может быть повышена введением ПМО, позволят создать высокоэффективные целллю-лазные препараты нового поколения.
Цель работы — изучение взаимодействия ЭГ1У с компонентами целлюлазного комплекса гриба P. verruculosum в процессе биодеградации целлюлозы, а также оценка перспективности создания продуцентов целлюлазных комплексов, содержащих не только гидролитические ферменты, но и ЭГ1У (а также другие ПМО), для гидролиза лиг-ноцеллюлозного сырья.
МЕТОДИКА
Ферментные препараты были получены в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН лиофильным высушиванием культуральных жидкостей исходного штамма P. verruculosum (PV-151), рекомбинант-ного штамма P. verruculosum с гетерологичной экспрессией эндоглюканазы IV (PV^nV) и ре-комбинантного штамма P. verruculosum (PV-БГЛ) с высокой гетерологичной экспрессией Р-глюко-зидазы из Aspergillus niger. В качестве источника целлобиозодегидрогеназы использовали ферментный препарат на основе гриба Chrysosporium luc-knowense (CL-ЦДГ). Модифицированный трипсин свиньи — препарат фирмы "Promega" (США).
Определение биохимических характеристик ферментов и ферментных препаратов. Для определения молекулярных масс белков и последующего MALDI проводили электрофорез ферментных препаратов в 12%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na на приборе Mini Protean ("Bio-Rad", США). Гели окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым синим R-250 ("Ferak", Германия). В качестве белков-маркеров использовали смесь Prestained Protein MW Marker ("Thermo scientific", США).
Масс-спектрометрический анализ. Для идентификации гетерологичного белка (3nV из T. reesei) использовали масс-спектрометический анализ его трипсинового гидролизата. Из геля после электрофореза вырезали фрагменты, молекулярная масса которых соответствовала рекомбинант-ному белку. Фрагменты геля отмывали от красителя и обрабатывали трипсином (5 мкг/мл, 50 мМ NH4HCO3). Полученные пептиды экстрагировали из геля и получали MALDI-TOF масс-спектры, используя систему AUTOFLEX II ("Bruker Daltonics", Германия). Анализ полученных масс-спектров осуществляли с помощью программы MASCOT (http://www.matrixscience.com/) в базе данных National Center for Biotechnology Information USA (NCBI), MSDB или SwissProt.
Определение ферментативных активностей. Активность препаратов и фракций после хроматографии определяли по отношению к п-нитро-фенил-Р^-глюкопиранозиду (ПНФГ) и ряду полисахаридных субстратов — микрокристаллической целлюлозе (авицелу, МКЦ), натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и глюкуронок-силану березы. Таким образом были характеризованы основные целевые компоненты карбогидразных препаратов, включающих Р-глюкозидазы, целло-биогидролазы, эндоглюканазы и ксиланазы соответственно.
Активность по отношению к ПНФГ определяли по начальной скорости образования окрашенного продукта — я-нитрофенола, концентрацию которого оценивали спектрофотометрически по изменению оптической плотности при 400 нм. Реакцию проводили в 0.1 M Na-ацетатном буфе-
BgIII
HindlH
Ap
HindIII EcoRI BamHI
promoter CBHI EcoRI
SigSeq p. ver
HindIII BgIII
egHV gene
HindIII
NotI
terminator CBHI
Рис. 1. Схема плазмиды pPrCBH-EGIV, несущей ген eglIV эндоглюканазы IV T. reesei.
ре, pH 5.0, в течение 10 мин при 40°С. Концентрация субстрата составляла 0.05 M. Реакцию останавливали добавлением раствора 1 M Na2CO3.
Активность по отношению к полисахарид-ным субстратам определяли по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС), концентрацию которых оценивали методом Шомоди—Нельсона. Реакцию проводили в 0.1 M Na-ацетатном буфере, рН 5.0, при 50°С. Концентрация полисахаридного субстрата в реакционной смеси составляла 5 г/л. Для определения активности по отношению к нерастворимой МКЦ реакционную смесь в течение эксперимента перемешивали.
Активность ферментов выражали в международных единицах. За 1 ед. принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта в течение 1 мин [17].
Содержание белка определяли по методу Лоури, в качестве стандарта использовали БСА.
Определение гидролитической активности ферментов по отношению к целлюлозе. В качестве субстрата была использована МКЦ МС-112 ("Витэк Групп", Россия). Гидролиз проводили в 0.1 М Na-ацетатном буфере, рН 5.0, в пробирках с закручивающейся крышкой пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.