ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 264-272
УДК 577.213.3
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ РЕПАРАЦИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ДНК-МАТРИЦ ПРИ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ ДЕГРАДИРОВАННОЙ ДНК
© 2014 г. А. П. Довгерд*, **, Д. О. Жарков*, **, ***
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, 630090 **ООО "СибАкадемТехнологии", Новосибирск, 630090 ***Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, 630090
e-mail: dzharkov@niboch.nsc.ru Поступила в редакцию 25.10.2013 г.
Повреждение ДНК-матриц представляет собой проблему при ПЦР-амплификации сильно деградированных образцов, которые включают древние ДНК, объекты судебно-экспертной практики и пищевые продукты глубокой переработки. Живые организмы обладают набором ферментов репарации, исправляющих повреждения в ДНК. В работе созданы и охарактеризованы модельные системы деградированной высокомолекулярной ДНК с преобладанием различных типов повреждений. Показано, что эффективность ПЦР резко снижается при апуринизации и окислении модельной плазмидной ДНК-матрицы. Определен состав ферментов, способных осуществлять полный цикл эксцизионной репарации отдельных повреждений. После обработки поврежденных модельных субстратов этим набором ферментов эффективность ПЦР возрастала по сравнению с эффективностью ПЦР образца, не подвергавшегося репарации.
DOI: 10.7868/S0555109914030210
Молекулы ДНК в клетке постоянно подвергаются действию различных повреждающих факторов окружающей среды, в число которых входят ультрафиолетовое излучение, космическая радиация, радиационный фон горных пород, активные формы кислорода и азота, возникающие при аэробном дыхании и иммунном ответе, ксенобиотики и т. п. [1, 2]. Для того чтобы предотвратить накопление повреждений, в живых организмах присутствуют ферментативные системы репарации ДНК [1]. Более 90% поврежденных нуклеотидов устраняется одной из них — системой эксцизионной репарации оснований (ЭРО). В ходе ЭРО ферменты четырех типов — ДНК-гли-козилазы, апурин-апиримидиновые (АП-) эндо-нуклеазы, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы последовательно катализируют удаление из ДНК поврежденного основания и дезоксирибозного фрагмента, включение корректного нуклеотида и восстановление ее разорванной цепи [1, 3, 4].
В отличие от метаболически активных тканей, в которых системы репарации ДНК активны, после смерти организма повреждения накапливаются в ДНК необратимо. Неблагоприятные физико-химические факторы (высокая температура и агрессивная химическая среда) значительно ускоряют процесс деградации ДНК. Накопление повреждений в ДНК может представлять проблему в тех случаях, когда необходимо провести анализ ее последовательности. Это особенно акту-
ально при исследовании древней ДНК, так как при работе с такими образцами возникает ряд методических проблем, связанных со сверхмалыми количествами ДНК, ее фрагментированностью и наличием модификаций, блокирующих ПЦР-ам-плификацию либо приводящих к неверному прочтению оснований ДНК-полимеразами [5]. Те же проблемы возникают при анализе ДНК в сложных случаях молекулярно-генетической экспертизы деградированных криминалистических образцов [6] и при анализе пищевых продуктов глубокой переработки [7], что осложняет или делает невозможным получение данных и их интерпретацию.
Спектр постмортальных повреждений ДНК достаточно широк, но лишь некоторые из них вносят значительный вклад в общее количество повреждений [8—11]. Фрагментация цепи или гидролитическая атака, которая приводит к разрыву связей дезоксирибозы с пуриновыми основаниями, быстро разрушает молекулу ДНК. ДНК также легко окисляется свободными радикалами, что приводит к модификации остатков дезокси-рибозы, окислению пиримидинов до соответствующих гидантоинов, а пуринов — до 8-оксопу-ринов и формамидопиримидинов, потере оснований и образованию внутри- и межцепочечных сшивок. Все эти повреждения блокируют активность ферментов ПЦР [9, 10]. Другие модифицированные основания не препятствуют амплифи-
Последовательности олигонуклеотидов, использованные в работе
Условное обозначение Последовательность
23oG 5'-CTCTCCCTTCXCTCCTTTCCTCT-3' (X = 8-оксогуанин)
23comp 5'-AGAGGAAAGGAGCGAAGGGAGAG-3'
23G 5'-CTCTCCCTTCGCTCCTTTCCTCT-3'
праймер 1 5'-CGCTTACAATTTCCATTCGC-3'
праймер 2 5' - GAGAAAGGCGGACAGGTATC - 3'
кации, но приводят к включению в синтезируемую цепь нуклеотидов, не присутствующих в исходной ДНК. Это может значительно затруднить анализ результатов. Большинство таких изменений возникает вследствие дезаминирования цитозина до урацила, образующего водородные связи по типу тимина, или аденина до гипоксан-тина, образующего водородные связи с цитози-ном, аденином и тимином [10, 11].
Таким образом, накопление повреждений в постмортальной ДНК резко снижает эффективность ПЦР, делая амплификацию ДНК в ряде случаев невозможной, и приводит к ошибкам при секвенировании ампликонов.
Цель работы — определение ферментов, эффективно осуществляющих репарацию ДНК, и их использование для улучшения качества деградированных ДНК-матриц.
МЕТОДИКА
Ферменты. В работе использовали полинук-леотидкиназу (КФ 2.7.1.78) и ДНК-лигазу (КФ 6.5.1.1) бактериофага T4 ("Биосан", Россия), ДНК-полимеразы (КФ 2.7.7.7) Taq и Pfu ("Сибэн-зим", Россия), фрагмент Кленова ДНК-полимера-зы I Escherichia coli ("New England Biolabs", США), РНКазу A (КФ 3.1.27.5) из поджелудочной железы крупного рогатого скота ("Sigma-Aldrich", США). Ферменты: 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу человека OGG1 апурин-апиримидиновую эндонукле-азу человека (APEX1), ДНК-полимеразу ß человека (POLß), эндонуклеазу IV E. coli (Nfo) и формамидо-пиримидин-ДНК-гликозилазу E. coli (Fpg) выделяли по описанным методикам [12—16].
Плазмиды и бактериальные штаммы. В работе использовали штамм E. coli DH5a (F-supE44 AlacU169 (ф80 lacZAM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) и плазмиду pBlueScript II SK(-) ("Agilent Technologies", США). Приготовление компетентных клеток E. coli, их трансформацию и выделение плазмидной ДНК осуществляли в соответствии с описанными методиками [17].
Олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды, использованные в работе, представлены в таблице. Введение радиоактивной метки по 5'-концу, очистку и отжиг проводили по описанным методикам
[17]. Двуцепочечные олигонуклеотиды обозначены кодами цепей, разделенными двумя косыми чертами, меченая цепь указана звездочкой (напр. 23oG*//23comp).
Получение модельных поврежденных ДНК-матриц. Для апуринизации модельной ДНК реакционная смесь (30 мкл) содержала 0.1 М НС1 и плазмидную ДНК в концентрации 0.1 мг/мл. Смесь инкубировали в течение 0—10 мин при 25 или 65°С. Реакцию останавливали, отбирая аликвоты по 5 мкл и добавляя к ним равный объем 1.0 М трис-основания.
Для повреждения ДНК гидроксильными радикалами реакционная смесь (20 мкл) включала 25 мкМ FeSO4, 100 мкМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ Н202, 120 мкМ ЭДТА и плазмидную ДНК в концентрации 0.25 мг/мл. Смесь инкубировали в течение 5—30 мин при 25°С. Реакцию останавливали добавлением этанола до конечной концентрации 20 мМ.
Для повреждения ДНК синглетным кислородом к 20 мкл раствора плазмидной ДНК (50 мкг/мл) в 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 8.0, содержащем 1.0 мМ ЭДТА, добавляли 2 мкл 0.1%-ного раствора метиленового синего. Образцы в прозрачных полипропиленовых пробирках помещали при рассеянном красном свете на лед и облучали с расстояния 30 см лампой накаливания с вольфрамовой нитью мощностью 400 Вт в течение 1—20 мин. После этого ДНК переосаждали этанолом в темноте. Для доказательства образования 8-оксогуанина в последовательности ДНК облученную плазмиду (8.0 мкг/мл) обрабатывали Fpg (2 мкМ) в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.5, содержащем, 100 мМ №С1, 1.0 мМ дитио-треитол и 1.0 мМ ЭДТА, в течение 10 мин при 25°С. Анализ продуктов реакции проводили с помощью метода электрофореза в агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием. Количество повреждений (Щ) в плазмидной ДНК оценивали после обработки Fpg в соответствии с моделью распределения Пуассона:
N = - 1п-1-,
1.4БМА! + БМА„
где DNAj и DNAn — интенсивность полос в геле, принадлежащих суперскрученной (форма I) и ре-лаксированной (форма II) ДНК соответственно. Прямая оценка количества повреждений была выполнена после 2 мин облучения. Количество повреждений после длительного облучения, вызывающего более глубокую деградацию ДНК, рассчитывали, исходя из линейной модели накопления повреждений во времени.
Репарация ДНК in vitro. При определении активности всех ферментов, а также реконструкции полного цикла репарации субстрата, содержащего 8-оксогуанин, реакционная смесь (20 мкл) содержала 60 мМ трис-НС1-буфер, pH 7.8, 1.5 мМ MgC12, 25 мМ KC1, 0.1%-ный тритон X-100 и 10 мМ Р-меркаптоэтанол. В смесь добавляли в разных комбинациях Fpg (5-150 нМ), Nfo (2-100 нМ), POLP (30 нМ), 100 мкМ дГТФ (или по 100 мкМ всех дНТФ), 1.0 мМ АТФ и 5 ед. активности ДНК-лигазы бактериофага Т4. Реакцию инициировали добавлением субстрата (23oG*//23comp) до концентрации 50 нМ и проводили в течение 60 мин при 25°C. Затем реакцию останавливали добавлением 20 мкл раствора, pH 8.0, содержащего 80%-ный формамид, 20 мМ ЭДТА, 0.1%-ный ксиленцианол и 0.1%-ный бромфеноловый синий, и нагреванием в течение 5 мин при 95°C. Анализ продуктов реакции проводили с помощью метода электрофореза в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 8 М мочевины. Для доказательства осуществления репарации после завершения реакции к реакционной смеси добавляли пятикратный избыток олиго-нуклеотида 23comp, нагревали до 95°C, медленно охлаждали до 25 °C, добавляли Fpg до концентрации 100 нМ и инкубировали в течение 60 мин при 25°C, после чего анализировали продукты, как описано выше. Репарацию поврежденной плаз-мидной ДНК проводили в тех же условиях с различными количествами ДНК.
Полимеразная цепная реакция. Реакционная смесь для ПЦР (50 мкл) содержала 60 мМ трис-HCl-буфер, pH 7.8, 1.5 мМ MgC12, 25 мМ KC1, 0.1%-ный тритон X-100, 10 мМ Р-меркаптоэта-нол, смесь дНТФ (50 мкМ каждого), праймеры 1 и 2 (0.1 мкМ каждого, таблица) и ДНК-полимеразу Taq (0.1 ед./мкл) или Pfu (0.05 ед./мкл)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.