МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 72-82
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.811.25
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ УГЛЕРОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ФИЛУМА CHLOROBI © 2014 г. Т. П. Турова*, **, 1, О. Л. Ковалева*, В. М. Горленко*, Р. Н. Ивановский**
* Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Кафедра микробиологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 16.05.2013 г.
Исследовалась возможность использования некоторых генов ферментов углеродного метаболизма в качестве молекулярных маркеров для изучения филогении и экологии зеленых серных бактерий (ЗСБ) филума СЫогоЫ. Сконструированные праймеры для амплификации генов АТФ-цитратлиазы (ас1В) и цитратсинтазы (¿1А) выявили соответствующие гены в геномах всех вновь изученных штаммов ЗСБ. При этом филогенетические деревья, основанные на анализе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей данных генов, были в основном конгруэнтны соответствующему дереву, основанному на анализе генов 168 рРНК, за единственным исключением: на О^А-дереве типовой штамм СЫогокегре(оп 1Ьа1аввшт образовывал отдельную ветвь вне кластера остальных представителей филума СЫогоЫ. Это свидетельствовало о возможности получения праймеров, избирательно специфичных для всех представителей филума СЫогоЫ, только для генов ас1В. Поэтому именно этот ген был использован в качестве молекулярного маркера для детекции ЗСБ в образцах накопительных культур и природных проб. Ас1В-филотипы зеленых серных бактерий были выявлены во всех изученных образцах, кроме природных проб, полученных из содовых озер. При этом идентификация выявленных филотипов соответствовала полученной при использовании известного специфичного для филума СЫогоЫ молекулярного маркера — гена БМО-белка (/то).
Ключевые слова: зеленые серные бактерии (ЗСБ), СЫогоЫ, вЦТК, АТФ-цитратлиаза, цитратсинтаза, филогения.
БО1: 10.7868/80026365614010157
Зеленые серные бактерии (ЗСБ) — физиологически однородная группа (облигатные анаэробы и аноксигенные фототрофы), образующая отдельную, обособленную от других бактерий линию эволюции (филум Chlorobi). До недавнего времени их систематика основывалась на морфологии клеток, составе пигментов и физиолого-биохимиче-ских особенностях [1, 2]. Все известные ЗСБ содержат антенные структуры — хлоросомы. В качестве важного признака, дифференцирующего различные рода внутри группы, рассматривалось образование газовых вакуолей. На видовом уровне большое значение придавалось цвету культур (зеленый/коричневый), обусловленному присутствием специфических каротиноидов (хлоробак-тина или изорениератина) и бактериохлорофиллов c, d или e. Однако сравнительный анализ последовательностей двух молекулярных маркеров — генов 16S рРНК, а также генов fmo, кодирующих FMO-белок реакционного центра фотосинтеза (Fenna-Matthews-Olson protein), специфический для представителей филума Chlorobi, привел к существенной реорганизации этой группы бактерий [3]. В результате штаммы, прежде относимые к
1 Автор для корреспонденции (e-mail: tptour@rambler.ru).
одному виду, в ряде случаев оказались распределены по нескольким разным видам и даже родам. Изменения классификации не затронули лишь виды, типовые штаммы которых отсутствовали в коллекциях, а также СМогокегре1оп йаШзшт [4], образовавший обособленную ветвь внутри кластера ЗСБ на филогенетических деревьях обоих типов и обладающий явными фенотипическими отличиями от других представителей филума СЫогоЫ. Данные сравнительного анализа тотальных геномов ЗСБ также свидетельствовали об обособленности представителей этого рода [5]. На основании этого недавно было предложено выделить бактерии, близкие к представителям рода СМогокегре1оп, в самостоятельное семейство СЫо-гокегре1опасеае внутри порядка Ск1огоЫае [6, 7].
Большинство представителей филума СЫогоЫ способно к автотрофной ассимиляции углекислоты, осуществляемой в результате функционирования восстановительного цикла трикарбоно-вых кислот (вЦТК) [8—10]. Этот цикл представляет собой обращенный окислительный цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, или цикл Кребса), в котором ферменты, катализирующие необратимые реакции — цитратсинтаза, МАЭ-зависимая 2-оксоглутаратдегидрогеназа и сукцинатдегидро-
геназа, заменены ферментами, способными катализировать обратные реакции (АТФ-цитратлиа-зой, ферредоксин-зависимой 2-оксоглутаратсин-тазой и фумаратредуктазой соответственно). Ключевой фермент вЦТК, АТФ-цитратлиаза, катализирующий ключевую реакцию вЦТК — АТФ-зависимую конверсию цитрата в ацетил-КоА и оксалоацетат, кодируется двумя генами ас1А и ас1В, которые найдены только в геномах прокариот, использующих вЦТК для автотрофной фиксации углекислоты. Кроме ЗСБ, это е-Рго1еоЪас1ег1а [11—13] и некоторые представители гипертермофильных водородокисляющих бактерий филума АдиШсае [14], а также "СапШёаШБ МкгоБрка ёеАи-уИ" филума МкгоБрнае [15]. Активность АТФ-цитратлиазы показана также для представителя ё-протеобактерий, сульфатредуктора ВеБиНо-Ъа^ег Ыуёго§епорЫПи5 [16], однако геномных данных по этому организму не имеется. Кроме того, у некоторых представителей АдиШсае и МкгоБрь гае ключевую реакцию вЦТК осуществляют 2 других фермента — цитрил-СоА-синтетаза и цит-рил-СоА-лиаза [17, 18]. Функционирование вЦТК согласно геномным данным предполагается также для некоторых представителей а-(Ма§-пеШсоссш Бр. МС-1) [19] и §- (автотрофные симбионты моллюсков) [20] протеобактерий. Причем для симбионтов моллюсков, по-видимому, вЦТК действует дополнительно к циклу Кальвина, что является уникальным случаем. В геномах этих организмов также были обнаружены гены ас1А и ас1В, кодирующие активную АТФ-цитрат-лиазу, которая, однако, предположительно принадлежит к новому типу (Тип II).
На основании анализа последовательностей генов ключевых ферментов вЦТК была предложена гипотеза об их эволюционных взаимоотношениях как друг с другом, так и с ферментом сук-цинил-КоА-синтетазой [14, 17].
До недавнего времени предполагалось, что фермент цитратсинтаза, катализирующий реакцию, обратную расщеплению цитрата, не принимает участия в механизме автотрофной ассимиляции СО2 с использованием вЦТК. Более того, предположительно, одновременное присутствие обоих ферментов в клетке может привести к циклическому синтезу и распаду цитрата, результатом которого будет бессмысленная трата энергии АТФ. Однако при исследовании ферментов вЦТК у ЗСБ наряду с активностью АТФ-зависимой цит-ратлиазы была обнаружена активность цитрат-синтазы [21, Ивановский, неопубликованные данные]. Кроме того, гены, кодирующие этот фермент (¡НА), были обнаружены во всех исследованных геномах представителей филума СЫ1о-гоЫ и в геномах некоторых представителей других филумов, способных к фиксации углекислоты через вЦТК. Для объяснения этого были выдвинуты гипотезы о функционировании у этих микроорганизмов либо неполного ЦТК [21], либо дополнительных ре-
акций в вЦТК [Ивановский, неопубликованные данные], которые пока остаются предметом дискуссий.
Целью данной работы была разработка олиго-нуклеотидных праймеров для детекции и секве-нирования генов aclB и gltA в геномах ЗСБ филума Chlorobi и оценка возможности использования полученных с их помощью результатов в филогенетических и молекулярно-экологических исследованиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования являлись штаммы микроорганизмов из коллекций кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ, недавно выделенные из разных источников штаммы ЗСБ (филум Chlorobi) из коллекции Института микробиологии РАН, а также накопительные культуры и природные пробы, происходящие из разных источников (табл. 1, 2).
Выделение и культивирование чистых культур, а также получение накопительных культур проводили, как описано ранее [22, 23].
Выделение тотальной ДНК. Для выделения ДНК применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма—Доли [24] и Wizard-технологии фирмы "Promega" (США).
Конструирование праймеров. Поиск нуклео-тидных последовательностей генов бета-субъеди-ницы АТФ-цитратлиазы (aclB) и цитратсинтазы (gltA) у представителей различных таксономических групп, включая ЗСБ филума Chlorobi, был проведен в международном банке данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей, построение консенсусной последовательности и поиск в ней консервативных участков проводили с помощью программы BioEdit со встроенным пакетом CLUSTALW (http://jwbrown. mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Для амплификации фрагментов генов fmo использовали ранее сконструированные праймеры, как описано в [25].
Амплификация и сиквенс фрагментов исследуемых генов. Амплификационная смесь (25 мкл) имела следующий состав: 1х буфер ДНК полиме-разы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 4 мМ MgCl2); по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 25 нг ДНК-матрицы; по 20 пмоль соответствующих праймеров и 1.5 ед. ДНК полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Россия).
Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый этап — 94°С х 9 мин; второй этап состоял из 30 циклов. Пример одного цикла — 94°С х 30 с, 56°С х 40 с, 72°С х 1 мин. Третий этап -72°С х 7 мин, 4°С. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей и неспецифичных продуктов реакции при помощи электрофореза в легкоплав-
Таблица 1. Объекты исследования: чистые культуры штаммов ЗСБ
Штаммы Филогенетическая идентификация Длина секвенированных фрагментов Коллекция Описание
ген aclB ген gltA
L Chlorobaculum parvum 863 826 Кафедра микробиологии Биологического факультета МГУ [27]
X Chlorobaculum limnaeum 860 826
C Chlorobaculum limnaeum 950 826
M 'Chlorobaculum macestae' 936 826 [22]
PhvPSl Chlorobium phaeovibrioides 971 Но ИНМИ РАН [23]
PrPS10 Chlorobium phaeovibrioides 971 Но
ChlvPS10 Chlorobium phaeovibrioides 971 Но
Примечание. Но — не определялось.
кой агарозе с применением набора Wizard PCR-Preps ("Promega", США). Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Секвенирование ПЦР продуктов проводили с п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.