ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 1, с. 44-50
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:582.675.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ IRAP-МЕТОДА для анализа генетической ИЗМЕНЧИВОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ РЕСУРСНЫХ И РЕДКИХ
ВИДОВ РАСТЕНИЙ
© 2010 г. С. В. Боронникова1, Р. Н. Календарь2
1 Пермский государственный университет, кафедра ботаники и генетики растений, Пермь 614990;
e-mail: SVBoronnikova@yandex.ru 2 Университет Хельсинки, Институт биотехнологии, Хельсинки 00014;
Южный биотехнологический центр, Одесса 650036; e-mail: ruslan.kalendar@helsinki.fi Поступила в редакцию 04.12.2008 г.
Видоспецифичные LTR-ретротранспозоны были впервые клонированы у пяти редких реликтовых лекарственных видов растений Пермского края. Последовательности LTR-ретротранспозонов были использованы для ПЦР-анализа, основанного на амплификации между повторяющимися последовательностями из LTR или другими участками ретротранспозонов (IRAP). Генетическая изменчивость изучена у шести популяций редкого реликтового вида растений Adonis vernalis L. с использованием IRAP-метода; проанализировано 125 полиморфных IRAP-маркеров. Определены показатели полиморфизма ДНК и генетического разнообразия популяций A. vernalis.
Мобильные генетические элементы являются обязательным компонентом генома эукариот. Барбара Мак Клинток установила, что в геноме кукурузы имеется множество перемещающихся элементов [1]. ДНК мобильных элементов у дрозофилы была выделена и клонирована группами Г.П. Георгиева и В.А. Гвоздева в СССР и Д. Хог-несса в США [2]. В настоящее время активно изучаются различные типы мобильных элементов, в том числе и ретротранспозоны, механизмы их транспозиции, роль в геноме, системы генетической нестабильности [3—5].
Ретротранспозоны используют как промежуточный этап жизненного цикла копирование своей РНК с помощью обратной транскрипции в ДНК-копию, которая встраивается в ДНК хозяина с помощью интегразы [6,7]. Последовательности ретротранспозонов несут регуляторные сайты (промоторы), опознаваемые ядерными факторами инициализации транскрипции для синтеза РНК — полимеразами II и III. Большая часть последовательностей ретротранспозонов инактивирована мутациями и транскрибируется только частично. У разных видов конкретные ретротранспозоны могут быть полностью неактивными, редко активными или постоянно активными [4]. В некоторых случаях число копий ретротранспозонов может составлять до 90% ядерного генома [6].
Последовательности LTR-ретротранспозонов используются для выявления полиморфизма между исследуемыми формами одного вида с помощью ПЦР-фингерпринта — IRAP, REMAP и SSAP методами [8-10]. В Alu-PCR (SINE-PCR)
используются участки между короткими ретро-транспозонами без LTR — SINEs (Short Interspersed Elements) [11, 12].
IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) — метод амплификации геномной ДНК между близкорасположенными последовательностями ретротранспозонов [8, 9, 13]. Продукт ПЦР-амплификации геномной ДНК является стабильным генетическим IRAP-маркером. Полиморфизм в данном случае обусловлен либо мутацией в участке связывания праймера, либо уникальным биологическим процессом — ретро-транспозицией, в результате встраивания ретро-транспозона в новый участок геномной ДНК без потери первоначального участка.
Цель настоящей работы — разработка метода IRAP для пяти редких реликтовых видов растений Пермского края посредством клонирования участков геномной ДНК, содержащих LTR-ре-тротранспозоны, и последующим подбором к ним праймеров; использование праймеров из ретротранспозонов для ПЦР-фингерпринта и генетического анализа полиморфизма шести популяций редкого реликтового вида A. vernalis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследований были избраны пять редких реликтовых распространенных в Пермском крае видов растений, имеющих декоративное и лекарственное значение: Adonis vernalis L. и Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. из семейства Ranunculaceae, Paeonia anomala L. из се-
мейства Paeoniacea, Adenophora lilifolia (L.)A.DC. из семейства Campanulaceae, Digitalis grandiflora Mill. из семейства Scrophulariaceae, с категорией угрожаемого состояния 3 (R) — редкий вид [14]. Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны листья с 30 случайно выбранных растений каждого вида на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Торреса и др. [15] с незначительными модификациями. Изучение популяционной структуры и молекулярно-генетический анализ пяти редких видов растений проведены с 1994 по 2009 г. в молекулярно-гене-тической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений Пермского государственного университета; клонирование, секвенирование последовательностей ДНК, подбор LTR-праймеров и выявление их эффективности проведены в лаборатории геномики растений Института биотехнологии Университета Хельсинки. Последовательности ретротранспозонов амплифицированы из геномной ДНК с помощью метода универсальных праймеров ретротранспозонов [16]. Экстракцию фрагмента ДНК из агарозного геля проводили по протоколу фирмы "QIAGEN", а лигирова-ние фрагментов ДНК — с pGEM-T ("Promega") плазмидным T-вектором. Плазмидную ДНК трансформировали в клетки E. coli штамма JM109. Клетки, несущие плазмиду со вставкой фрагмента чужеродной ДНК, были выявлены путем бело-синей селекции на среде с ампициллином, X-Gal и IPTG. Проверка положительных колоний на наличие клонированных ПЦР-продук-тов проведена с помощью ПЦР с универсальными pUC-праймерами (M13 прямым и обратным). Секвенирование последовательностей ДНК проведено с использованием капиллярного секвена-тора ABI3700 ("Applied Biosystems"). Клонирование целой последовательности ретротранспозона проводилось с помощью инвертированной ПЦР с протяженным синтезом, с использованием близкорасположенных LTR-праймеров, ориентированных в противоположные стороны. Получаемый продукт амплификации содержит обе последовательности LTR и полную центральную последовательность ретротранспозона. Амплификация проводилась при высокой температуре отжига — двухступенчатая ПЦР (95°C 30 с, денатурация, 68°C 4 мин отжиг праймера и синтез одновременно) в течение 15 циклов, с использованием Phusion DNA Polymerase ("Finnzymes"). Клонирование длинных продуктов амплификации проводили, как в случае с короткими продуктами ПЦР, в pGEM-T векторе, предварительно подготовив продукт амплификации для лигиро-вания, добавив к "тупым" концам по dT на 3'-концы, с помощью Тод-полимеразы. В соответствии с консервативными участками LTR-ретро-транспозонов в различных ориентациях были
разработаны праймеры с использованием программы FastPCR [17]. Для IRAP-анализа пяти редких видов Урала синтезированы 70 праймеров в "MWG Biotech AG".
Для апробации выявленных IRAP-маркеров избран перспективный для лечения сердечно-сосудистых заболеваний редкий вид A. vernalis, содержащий сердечные гликозиды, не обладающие кумулятивным эффектом и не накапливающиеся в сердечной мышце [18]. Исследованы шесть популяций A. vernalis, расположенных в островной Кунгурской лесостепи на расстоянии не менее 20 км друг от друга. Cамая северная популяция (вторая Av2) находится на Cпасской горе в Кун-гурском районе и удалена от ближайшей популяции на 45 км. В северной части Кунгурской лесостепи в Ординском районе располагаются первая (Av1) и третья (Av3) популяции. В центральной части островной Кунгурской лесостепи в Октябрьском районе находятся четвертая (Av4), пятая (Av5) и шестая (Av6) популяции.
Реакционная смесь объемом 25 мкл для ПЦР IRAP-методом содержала: 25 нг ДНК, 1x ПЦР буфер (20 мМ Tris-HCl, pH 8.8, 2 мМ MgSO4, 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4), 0.2 мкМ праймер, 0.2 мМ dNTP, 1 U Taq-полимеразы FirePol ("Solis BioDyne"), 0.04 U pfu-полимеразы ("Fermentas") и 5 мкл геномной ДНК. Амплификация была выполнена в PTC-100 термоциклере ("Bio-Rad") или MasterCycler ("Eppendorf") в 0.2 мл пробирках или 96-луночных плашках. Амплификацию ДНК проводили по следующей программе: предварительная денатурация 950C, З мин; З2 цикла 950C, 20 с; 600C отжига, 1 мин; 680C, 1 мин. Последний цикл элонгации длился 5 мин при 680C. Температура отжига в зависимости от G/C-соста-ва праймеров варьировала от 55 до 680C. Ампли-фицированные продукты ПЦР были анализированы электрофорезом в 1.6%-ном агарозном геле ("RESolute Wide Range", "BlOzym") и визуализированы этидием бромистым. Гели были отсканированы в Университете Хельсинки на сканере FLA-5100 ("Fuji") или в Пермском государственном университете в системе Gel-DocXRW ("BioRad"). Для определения длины фрагментов ДНК использовали молекулярный маркер 100 bp + 1.5 + + З КЬ DNA Ladder ("ООО-CибЭнзим-M", Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе Gel Doc XR ("Bio-Rad"). Эффективность выявления полиморфизма ДНК рассчитана для пяти исследованных видов в соответствии со шкалой 1—5: от низкой (1) до высокой (5). Для описания генетической структуры подразделенной популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции, как мера
а M1 2345678 9 1011 1213 1415 161718 19 20 2122 23 24 25 26 27 28 29 1500 —
1000
500
б M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
L liltlÊlUr
500
Рис. 1. IRAP-спектры A. vernalis: а — популяции Av5 с праймером 2079 (5'-AGGTGGGCGCCA-3'), в результате использования метода универсальных праймеров ретротранспозонов; б — популяции Av6 с праймером 2204. Цифрами обозначены номера проб; М — молекулярный маркер; стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК. Представлена часть спектров.
ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии, или показатель под-разделенности популяций (GST) [19]. Компьютерный анализ полученных данных проведен с использованием программы POPGENE1.31 и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В данной работе для амплификации последовательностей ретротранспозонов из геномной ДНК использован (рис. 1,а) оригиналь
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.