ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 428, № 3, с. 407-410
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.341:591.391
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАЗЕРА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
РЕЦИПИЕНТНЫХ ЦИТОПЛАСТОВ ПРИ ПЕРЕСАДКЕ ЯДЕР У МЛЕКОПИТАЮЩИХ © 2009 г. А. К. Шахбазян, Т. А. Свиридова-Чайлахян, А. В. Карменян,
А. С. Кривохарченко, А. Чои, член-корреспондент РАН |Л. М. Чайлахян
Поступило 06.04.2009 г.
Исследования биологических объектов на уровне отдельных клеток с использованием приемов микрохирургии активно проводятся с начала прошлого века и во многом связаны с именем известного биофизика С.С. Чахотина, разработавшего для этой цели уникальные микроманипуля-ционные приборы. Он также был одним из первых, кто пришел к идее заменить механическое вмешательство в клетку микроинструментами на оптические способы манипулирования с помощью сфокусированного ультрафиолетового излучения и блестяще осуществил ее [1]. С появлением лазеров и лазерной фотобиологии оптические приемы воздействия на клетки и клеточные орга-неллы получили свое дальнейшее развитие [2—4]. В настоящее время спектр практического применения лазеров в медицине и биологии довольно широк, однако до сих пор отсутствуют исследования на ранних эмбрионах млекопитающих в целях терапевтического и репродуктивного клонирования.
Одним из ключевых этапов клонирования является энуклеация — удаление или инактивация генома ооцитов или зигот с целью получения ре-ципиентных цитопластов для последующего введения донорских ядер. Для получения цитопла-стов в основном используют различные варианты механической энуклеации [5—7]. Относительно недавно стали также использовать химическую энуклеацию [8, 9]. На сегодняшний день эффективность клонирования остается весьма низкой, в том числе из-за этапа энуклеации, поскольку механическое инвазивное извлечение ядра неизбежно связано с уменьшением объема цитопласта
Институт теоретической
и экспериментальной биофизики
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Институт биофотоники
Ян-Мин Университета, Тайпей, Тайвань
Центр молекулярной медицины им. Макса Дельбрука,
Берлин, Германия
и, вероятно, вследствие этого со снижением его репрограммирующей способности, а при химической энуклеации ооциты или зиготы подвергаются воздействию токсических веществ, что также может приводить к снижению их жизнеспособности.
Таким образом, остается актуальным поиск принципиально новых методов, позволяющих проводить на клеточном уровне максимально щадящие операции с высокой точностью. Наиболее перспективным подходом, способным существенно повысить эффективность манипуляций с ранними эмбрионами млекопитающих, являются оптико-лазерные технологии и, в частности, использование лазерного облучения для инактивации ядер клеток-реципиентов. В настоящей работе впервые показана возможность лазерной энуклеации ооцитов и зигот мышей для получения реципиентных цитопластов.
Работа выполнена на мышах CBA и C57BL/6, возраст которых составлял 1.5—2.5 мес. Суперовуляцию самок C57BL/6 проводили гормонами PMSG (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, "Sigma") и hCG (человеческий хорионический гонадотропин, "Sigma") по стандартной методике. Ооциты на стадии метафазы II выделяли из яйцеводов через 15—18 ч после инъекции hCG. Для вымывания ооцитов использовали среду М2 ("Sigma") с добавлением 0.1%-ной гиалуронида-зы ("Sigma"), способствующей удалению кумулу-сных клеток. Затем ооциты промывали в среде М16 ("Sigma") и сразу проводили партеногенетиче-
скую активацию с помощью стронция (2 мМ Sr+ в среде М16) в соответствии с методикой [10]. После 30 мин обработки стронцием их снова тщательно промывали и затем культивировали in vitro в 4-луночных пластиковых чашках "Nunclon" ("NuncTM" Gibco Europe Ltd) в среде М16 в инкубаторе "REVCO Elite II" (США) при температуре 37°С и 5%-ном СО2 в воздухе. Через 6 ч инкубирования отбирали ооциты с четко видимым про-нуклеусом и использовали их в экспериментах по
408
ШАХБАЗЯН и др.
(б)
Рис. 1. Лазерная энуклеация зигот. а — облучение лазером ядрышка в мужском пронуклеусе (показано стрелкой); б — облучение лазером ядрышка в женском пронуклеусе (показано стрелкой).
лазерной энуклеации. Для получения зигот гормонально обработанных самок C57BL/6 спаривали с самцами CBA. Зиготы на стадии пронуклеусов выделяли из яйцеводов самок через 24 ч после введения hCG. Вымывание зародышей проводили с помощью среды М2.
Для лазерной энуклеации использовали инвертированный микроскоп Olympus IX71 (Япония), сопряженный с лазером Tsunami ("Laser Spectra Physics", США), работающим в пикосе-кундном режиме с частотой повторения 80 МГц
на длине волны 800 нм, средняя мощность излучения изменялась в пределах от 0.08 до 0.8 Вт. Ооциты и зиготы помещали в специальную экспериментальную камеру из двух покровных стекол [11]. Все манипуляции проводили в среде М2. После проведения манипуляций клетки культивировали in vitro в среде М16 течение 24—72 ч. В качестве контроля использовали интактные активированные ооциты и зиготы.
Были проведены две серии экспериментов: 1) облучение лазером мужского и женского пронуклеусов в зиготах с целью их энуклеации; 2) облучение лазером пронуклеуса в активированных ооцитах с целью их энуклеации. Конкретной мишенью были выбраны ядрышки, которые четко видны как в женском, так и в мужском пронукле-усе. В первой серии экспериментов установлены параметры лазерного воздействия и подобрано оптимальное время для лазерной энуклеации зигот до объединения мужского и женского пронуклеусов. Обнаружено, что однократное облучение одного из ядрышек последовательно в мужском и затем в женском пронуклеусах лазерными импульсами мощностью 0.1—0.3 Вт и продолжительностью 0.02 с (рис. 1) приводит к блокированию развития эмбрионов. Только 6% зигот завершили первое деление дробления до 2-клеточной стадии, но в дальнейшем их развитие in vitro также останавливалось (табл. 1).
Лазерное облучение цитоплазмы вне зон нахождения пронуклеусов импульсами с такими же параметрами не оказывало какого-либо негативного воздействия на зиготы, и их последующее доимплантационное развитие в культуре in vitro было сопоставимо с развитием контрольных (не-облученных) зародышей (табл. 1). Энуклеирован-ные зиготы после 24 ч культивирования окрашивали витальным флуоресцентным ДНК-красителем Hoechst 33342 (5 мкг/мл в среде М2), а затем исследовали под ультрафиолетовым светом. Как показали наблюдения, остановившиеся в развитии зиготы сохраняли нормальную морфологию (рис. 2).
Таблица 1. Лазерная энуклеация зигот и активированных ооцитов*
Группа Всего зигот/ооцитов Развитие до 2-клеточ-ной стадии, % Развитие до стадии мо-рулы и бластоцисты, %
Энуклеация мужского и женского пронуклеусов в зиготах 33 6 (2/33) 0
Двухкратное облучение цитоплазмы зигот вне зоны пронуклеусов 30 97(29/30) 93 (28/30)
Интактные зиготы 135 95(128/135) 95(128/135)
Энуклеация пронуклеуса в активированных ооцитах 47 15 (7/47) 0
Интактные активированные ооциты 42 69 (29/42) 38(16/42)
* В скобках — слева число развившихся зигот или ооцитов, справа — общее чилсо взятых зигот или ооцитов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАЗЕРА
409
Рис. 2. Визуализация пронуклеусов зигот в ультрафиолете с помощью флуоресцентного ДНК-красителя Hoechst 33342. а — зиготы до энуклеации лазером; б — энуклеированные зиготы через 24 ч культивирования in vitro.
В следующей серии экспериментов проводили энуклеацию предварительно активированных ооцитов на стадии образования пронуклеуса (рис. 3а). Лазерную энуклеацию осуществляли облучением одного из ядрышек в четко видимом пронуклеусе ооцитов такими же импульсами, что и при энуклеации зигот (рис. 3б). При культивировании in vitro только 15% таких ооцитов (табл. 1) доходило до стадии двух бластомеров с последующей полной остановкой развития. Результаты всех опытов представлены в табл. 1.
Полученные нами результаты демонстрируют высокую точность действия лазера и эффективность такого способа энуклеации реципиентов. Облучение ядрышек в пронуклеусах полностью блокирует развитие зигот и активированных ооцитов, при этом и пронуклеусы, и клетки в целом длительное время сохраняют нормальную морфологию. Это указывает на то, что цитоплазма и клеточная мембрана не повреждаются лазером, и означает высокий потенциал таких клеток
Рис. 3. Лазерная энуклеация активированных ооцитов. а — активированный ооцит с пронуклеусом; б — облучение пронуклеуса лазером (показано стрелкой).
в качестве реципиентов ядер. Инактивацию пронуклеусов при локальном облучении одного из ядрышек можно объяснить функциональной значимостью этих структур, которые содержат главным образом рибосомальные гены (рДНК), рибо-сомальную РНК (рРНК) и соответственно определяют образование клеточных рибосом, играя важную роль в синтезе белков [12—14]. Наши данные согласуются с работой, в которой было показано, что механическое удаление ядрышка из пронуклеусов блокирует развитие ранних эмбрионов млекопитающих [15]. Процесс энуклеации с помощью традиционной механической микрохирургии связан со значительным инвазивным воздействием на зародышевые клетки. Извлечение генетического материала микроинструментами по существу представляет собой искусственное деление оперируемой клетки на безъядерный ци-топласт и кариопласт. Несмотря на высокую степень пластичности эмбриональных клеток, такие приемы являются в серьезной степени травмирующими. В то же время энуклеация лазером представляет собой неинвазивное воздействие с сохранением всего объема и целостности клетки.
410
ШАХБАЗЯН и др.
Таким образом, в настоящей работе впервые показана возможность эффективной замены механической и химической энуклеации неинвазив-ным локальным инактивирующим воздействием лазера на ядро без повреждающего воздействия на другие органеллы клеток. Определены необходимые параметры интенсивности и длительности воздействия лазерного импульса, точки фокусировки при энуклеации. Полученные нами данные открывают новые возможности использования лазера в исследованиях по клеточной инженерии на зародышах млекопитающих, что актуально для различных прикладных биомедицинских направлений, в том числе связанных с регенеративной медиц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.