УДК 576.315
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛИЛ-ГЛИЦИЛ-ПРОЛИНА (PRO-GLY-PRO)
НА ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ
© 2013 г. Н. С. Бондаренко*, А. И. Юсипович, С. С. Коваленко, Г. Н. Копылова, Б. А. Умарова, Е. Э. Граевская, Г. В. Максимов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12;
*электронная почта: n.s.bondarenko@gmail.com Поступила в редакцию 18.11.2012 г.
Исследовали действие пептида пролил-глицил-пролина (РЯО-ОЬУ-РЯО) на морфометрические параметры тучных клеток при их активации фрагментом АКТГ1-24 (синактеном) и веществом 48/80. Полученное с помощью метода лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) изображение клетки представляет собой распределение величины оптической разности хода света (ОРХ) и позволяет оценить изменение как состояния отдельных компонентов цитоплазмы (максимальная величина ОРХ, макс. ОРХ), так и суммарного распределения ОРХ ("количество вещества" клетки). Изменение "количества вещества" цитоплазмы коррелирует с изменением количества секретируемого клетками гистамина (—0.86). Действие 6 х 10-5 М РЯО-ОЬУ-РЯО не приводит к изменениям площади, макс. ОРХ и "количества вещества" тучной клетки. Активация клеток синактеном (2 и 20 мкМ) наряду с выбросом гистамина приводила к увеличению площади клетки, снижению макс. ОРХ и уменьшению "количества вещества", а прединкубация с РЯО-ОЬУ-РЯО с последующей активацией синактеном предотвращала выявленные изменения. При активации тучных клеток веществом 48/80 (0.02 мг/мл) наблюдалось снижение "количества вещества" и макс. ОРХ, увеличивался также выброс гистамина. Однако предварительная инкубация клеток с РЯО-ОЬУ-РЯО не оказывала влияния на эти изменения. Таким образом, протективное действие РЯО-ОЬУ-РЯО проявлялось при активации клеток си-нактеном, но не веществом 48/80.
Ключевые слова: тучные клетки, пролил-глицил-пролин (РЯО-ОЬУ-РЯО), вещество 48/80, синак-тен, лазерная интерференционная микроскопия (ЛИМ).
Б01: 10.7868/80233475513030031
Тучные клетки — один из типов клеток, участвующих в индукции, поддержании и распространении процесса воспаления. Эти процессы сопровождаются увеличением числа тучных клеток в очаге воспаления, их активацией и высвобождением большого количества провоспалительных медиаторов [1—3]. Однако избыточная активация тучных клеток часто приводит к развитию хронических воспалительных процессов или анафилак-тоидных и анафилактических реакций.
Ранее нами было показано, что короткие регу-ляторные пептиды, относящиеся к семейству глипролинов, представителем которого является РЯО-ОЬУ-РЯО, способны оказывать противовоспалительное действие. Так, РЯО-ОЬУ-РЯО и его метаболиты снижают степень выраженности или предотвращают развитие нарушений микроциркуляции в брыжейке крыс при экспериментальном остром перитоните [4]. Определенную
роль в реализации защитного эффекта глипроли-нов играет их способность препятствовать усилению активации тучных клеток [5] и уменьшать выброс из них физиологически активных соединений, в том числе гистамина. В экспериментах in vitro показано, что PRO-GLY-PRO уменьшает секреторный ответ тучных клеток при их активации синактеном, но не веществом 48/80, что, по-видимому, обусловлено различной природой и механизмом действия этих активаторов [6]. Однако остается неясным, какие морфологические изменения тучных клеток сопряжены с защитным действием PRO-GLY-PRO при их активации веществами различной природы.
Цель нашей работы состояла в сравнительном изучении действия PRO-GLY-PRO на морфологию и состояние цитоплазмы тучных клеток при их активации веществом 48/80 и синактеном. Для этого мы использовали высокочувствительный,
неинвазивный метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ), успешно применяемый для исследования функционирующих клеток (изолированных нейронов [7], нервного волокна [8], эритроцитов [9—11], макрофагов [12], а также различных микробиологических объектов) [13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Метод выделения перитонеальных тучных клеток крыс. Тучные клетки выделяли по стандартной методике [14]. Животных под эфирным наркозом декапитировали и обескровливали. Делали надрез брюшной полости и вводили 10 мл HEPES-NaCl (145 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7.4). Массировали брюшную стенку в течение 1 мин. Перитонеальную жидкость собирали и центрифугировали 5 мин при 800 об/мин (~82 g) и температуре 4°С. Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 2 мл HEPES-NaCl (рН 7.4).
Для очистки тучные клетки наносили на градиент фиколла-400 (2 мл фиколла 35% и 3 мл фи-коллла 25% в буфере HEPES-NaCl). Перед использованием фиколла добавляли глюкозу (5 мМ) и бычий сывороточный альбумин (BSA, 0.03%). После нанесения на фиколл клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин (~185 g) и 18°С. Тучные клетки трижды отмывали с последовательным центрифугированием в течение 10 мин при 1000, 800 и 600 об/мин (130, 82 и 46 g соответственно) в сбалансированном буфере (HEPES-NaCl рН 7.4), 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы и 0.1% BSA). Осадок тучных клеток разводили в необходимом объеме сбалансированного буфера.
Эксперименты на животных проведены с соблюдением международных принципов Хельсин-ской декларации о гуманном отношении к животным.
Фиксация тучных клеток. 30 мкл раствора, содержащего тучные клетки, помещали на зеркальное предметное стекло, добавляли раствор глута-рового альдегида (Sigma, США) до конечной концентрации 2.5%. Через 1 ч образцы промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе.
Перед измерением, для увеличения прозрачности, на образцы наносили 10 мкл водного раствора (1 : 1) глицерина (Sigma, США), накрывали покровным стеклом и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.
Метод определения гистамина тучных клеток.
Использовали стандартный метод определения гистамина [15], основанный на реакции конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом и образовании флуоресцирующего комплекса. Активацию клеток останавливали, доводя объем проб (100 мкл) до 400 мкл охлажденным сбалансированным буфером, и помещали на холод на 5 мин. Затем пробы центрифугировали в течение
10 мин при 1600 об/мин (330 g) и определяли содержание гистамина в супернатанте (высвободившийся гистамин) и осадке (остаточный гистамин).
Для определения высвободившегося гистамина к 100 мкл супернатанта добавляли 20 мкл 1 н. NaOH, а затем 10 мкл 0.1% раствора ортофталево-го альдегида. Через 4 мин добавляли 10 мкл 3 н. HCl. После добавления каждого реактива смесь тщательно перемешивали.
Для определения остаточного гистамина осадок растворяли в 400 мкл сбалансированного буфера, тучные клетки разрушали кипячением на водяной бане в течение 5 мин, центрифугировали в течение 10 мин при 1600 об/мин (330 g) и отбирали по 100 мкл супернатанта. Дальнейшую обработку проб проводили, как при определении высвободившегося гистамина.
Флуоресценцию измеряли на спектрофлуори-метре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 335 нм.
Выход гистамина определяли по формуле:
количество секретируемого гистамина (%) = = A/(A + B) х 100%,
(1)
где А — содержание высвободившегося гистамина, В — содержание остаточного гистамина.
Лазерная интерференционная микроскопия.
Принцип действия ЛИМ основан на измерении локальных фаз света, отраженного объектом. Луч лазера разделяется на два, один из которых проходит через клетку, в результате чего может измениться его фаза. Другой луч является контрольным и не проходит через объект. При наложении отраженного и контрольного луча формируется интерференционная картина (фазовое изображение объекта). Метод ЛИМ измеряет оптическую разность хода (ОРХ) двух лучей (фазовая высота, Ф [7]).
Используя ЛИМ, можно оценивать количество вещества m в клетке [8]:
m =
(n - Пт)
Ф S
^mean^ >
(2)
где Фте(т — среднее значение величины ОРХ в клетке, S — площадь клетки, а также п1П — показатель преломления окружающей среды — измеряемые параметры, а р — удельная плотность вещества и п — показатель преломления вещества — константы.
В случае клеток с однородным содержимым (например, безъядерные эритроциты, основное содержимое которых — гемоглобин) величина m, рассчитанная при помощи формулы (2), отражает реальное количество вещества. В случае клеток, в состав которых входят вещества с разными показателями преломления, значение m отражает суммарные изменения общего количества вещества в клетке.
OPX, нм
Рис. 1. Типичные световые (а) и фазовые (б) изображения различных типов тучных клеток в контрольных пробах; в — поперечное сечение фазового изображения (белая линия на части б).
После фиксации клетки помещали в смесь глицерин: вода (в соотношении 1 : 1 по объему), показатель преломления которой составлял 1.404. Предполагалось, что основным компонентом фиксированных клеток является белок, удельную плотность которого принимали равной 1.36 г/см3, а показатель преломления равным 1.56.
Исследования проводили с использованием автоматизированного интерференционного мик-ропрофилометра МИА-1, разработанного в институте ВНИИОФИ (Москва, Россия) на базе микроинтерферометра Линника МИИ-4 (ЛОМО, Россия) [11, 16]. Вертикальная чувствительность прибора не меньше ^/200, а латеральная разрешающая способность не меньше 0.5 мкм.
Обработка фазовых изображений. Обработку фазовых изображений, а также оценку площади, максимальной и средней величины ОРХ (фазовой высоты), проводили с помощью программы FIJI [17], варианта программы ImageJ. Дальнейшую статистическую обработку выполняли при помощи программы Statistica 6.0. Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Манна—Уитни при р < 0.05. Величину корреляции оценивали при помощи коэффициента корреляции Пирсона.
При статистической обработке оценивали не менее 15 клеток от одной пробы.
Состояние тучных клеток оценивали с использованием следующих параметров:
площадь клетки — площадь фазового изображения клетки, соответствует площади измеряемых клеток;
максимальная ОРХ клетки — максимальное значение ОРХ клетки, обусловленное локальным распределением, количест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.