РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 2, с. 151-169
ОБЩАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ =
УДК [57+61]:539.1.047:53.083.98:533.9.082.74
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАГНИТОРЕЗОНАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
ПРИ СИСТЕМНОМ АНАЛИЗЕ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ/РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
© 2013 г. В. Л. Шарыгин1*, |М. К. Платова]', А. Е. Сипягина2, Л. С. Балева2
Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Москва 2Детский научно-практический центр противорадиационной защиты ФГБУ "Московский НИИ педиатрии
и детской хирургии"Минздравсоцразвития России
Рассмотрены молекулярные механизмы синтеза дезоксирибонуклеотидов, ДНК и белков в тканях кроветворных органов, а также изменения пулов Ре3+-трансферрина и Си2+-церулоплазмина и внеклеточной ДНК в крови и плазме крови животных под действием у-радиации в разных дозах. Установлена $0$-активация синтеза дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, РНК, ДНК и белков, которая определяет эффективность репарации на ранних пострадиационных сроках. Дальнейшее развитие компенсаторно-восстановительных реакций клеточных систем связано с периодом ингибирования и последующим повышением активности рибонуклеотидредуктазы, обеспечивающей репарацию ДНК за счет индукции синтеза дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Параллельно контролируемые методом ЭПР изменения пулов Ре3+-трансферрина и Си2+-церулоплазмина в цельной крови, плазме и сыворотке крови, а также содержания внеклеточной ДНК в плазме крови могут использоваться в качестве маркеров радиочувствительности организма. Информативность этих показателей засвидетельствована не только в экспериментах на животных, но и при обследовании состояния здоровья ликвидаторов аварии на ЧАЭС, гражданского взрослого населения и детей, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Брянской области.
Метод ЭПР, дезоксирибонуклеотиды, ДНК, белки, ¥в3+-трансферрин, Си2+-церулоплазмин, внеклеточная ДНК, /-радиация, радиочувствительность организма животного и человека.
БО1: 10.7868/80869803113010141
Природа и механизмы радиочувствительности и радиорезистентности недостаточно определены, хотя ответить на этоти вопросы ученые стремятся уже десятки лет [1—3]. Новые экспериментальные подходы следует искать с учетом прежде всего роли репарации ДНК в поддержании целостности генома, клеточной стабильности и организма млекопитающих в целом. Определяющую роль играет не только исходная радиочувствительность, но и интегральный функциональный резерв организма, обеспечивающий возможность к быстрому и эффективному восстановлению клеточных систем после облучения. Речь идет об адекватном метаболическом ответе живых систем по восстановлению энергообеспечения, скорости биосинтеза макромолекул ДНК, РНК и белков, детоксикации и кроветворения. Использование физического метода ЭПР в одном эксперименте с радиоизотопными и биохимическими методами при параллельном изуче-
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Косыгина, 4; ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН; тел. (495) 939-73-59; е-таП:8Иагу^т@сИрИ.га8.т.
нии метаболических показателей крови и органов у- облученных животных позволило получить информацию о молекулярно-клеточных реакциях, определяющих механизмы радиочувствительности/радиорезистентности [4]. В итоге оформился принципиальный подход в изучении возможных генетических последствий дисбаланса пула нук-леотидов и/или скоростей синтеза ДНК, РНК и белка, вызванных нарушениями физиологического гомеостаза клеток организма в целом. Точность и широта охвата достигается за счет анализа данных комплементарных методов, характеризующих динамические перестройки метаболических систем жизнеобеспечения в радиогенных условиях. Важно было использовать новые технологии и критерии оценки негативных последствий аварии на ЧАЭС для детей и взрослого гражданского населения, продолжающих проживать на загрязненных радионуклидами территориях [5].
Результаты этих исследований способствовали развитию биологического мониторинга за метаболическими показателями и состоянием здоровья детей и выявление групп повышенного риска
после радиационного воздействия. Согласно последним данным, наблюдалась гиперчувствительность детского организма к радиационному фактору с высокой вероятностью риска развития экопатологии [6, 7]. Закономерности радиационного мутагенеза, опухолевой трансформации в результате структурных нарушений генома, возникновения иммунодефицита вследствие радиационной гибели клеток лимфоидной ткани, включая зрелые лимфоциты, и других возможных последствий радиационного повреждения при действии ионизирующих излучений (ИИ), вероятно, связаны количественными зависимостями между скоростью и качеством репарации повреждений ДНК, выраженностью активации сигнальных механизмов апоптоза и метаболических перестроек клеточных систем в облученном организме. Особый интерес представляют вопросы наследственной изменчивости и анализа на молекулярном уровне механизмов действия ионизирующей радиации в малых дозах на организм детей и взрослых. Успех в решении практических задач радиобиологии человека во многом определяется анализом и решением фундаментальной проблемы индивидуальной неспецифической радиочувствительности и радиорезистентности с позиций "учения об основных управляющих внутриклеточных системах, родившихся из хромосомной теории наследственности" [1].
Эксперименты на собаках, мышах и крысах позволили установить в крови маркеры изменения резистентности организма к действию излучения в условиях применения радиопротекторов [5—10]. Оказалось, что такими маркерами могут быть Ре3+-трансферрин (Ре3+-ТФ), Си2+-церуло-плазмин (Си2+-ЦП), внеклеточная ДНК (ВКДНК) и др. В дальнейшем они были использованы для оценки эффективности и сроков повышения резистентности организма человека при клинических испытаниях новых перспективных радиопротекторов в условиях их введения в организм, а также при обследовании состояния здоровья детей, ликвидаторов, взрослого населения, пострадавших в результате радиационной аварии.
Таким образом, одной из задач работы было установление молекулярных и клеточных показателей, позволяющих оценить степень выраженности, динамику и дозовую зависимость метаболических изменений у лиц, проживающих в районах с повышенным фоном радиоактивного загрязнения, с тем, чтобы попытаться прогнозировать негативные отдаленные последствия радиационного воздействия; выяснить зависимость изучаемых реакций организма на облучение от его исходной радиочувствительности для того, чтобы использовать эти данные при создании средств защиты.
ФЕРМЕНТ РИБОНУКЛЕОТИДРЕДУКТАЗА И ЕГО РОЛЬ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТАХ РАДИАЦИИ
Современные представления о защитных реакциях организма на действие ДНК-повреждающих факторов предполагают наличие SOS-подобного ответа, направленного на срочную ликвидацию радиационно-индуцированных повреждений ДНК, и более позднего компенсаторно-восстановительного ответа клеточных систем, приводящего к восстановлению клеточного состава органов и тканей, нормализации метаболических процессов. Во время SOS-ответа активируется комплекс ферментов экстренной репарации, ключевым звеном которой является индукция синтеза рибонуклео-тидредуктазы (RR) [8—15].
Фермент RR содержит в активном центре железосодержащей субъединицы B2 свободный радикал тирозинового аминокислотного остатка полипептидной цепи, необходимый для проявления его каталитической активности. Белок субъединицы B1 фермента RR содержит два типа центров аллостерической регуляции, как общей активности, так и субстратной специфичности, определяющей синтез четырех типов дезоксинук-леотидов, а затем и их трифосфатов (dNTP). Эффекторами общей активности являются ATP (активация) и dATP (ингибирование), а субстратной специфичности RR — четыре типа дезоксинук-леотидов, определяющих последовательность их синтеза. Отсюда следует, что восстанавливающая рибонуклеотиды активность RR зависит от синтеза ATP. Для проявления энзиматической активности RR необходим кислород: одна из субъединиц RR — белок B2 содержит пару антиферромаг-нитно связанных ионов трехвалентного железа, связанную кислородным мостиком — концевым акцептором электронов в молекуле RR, который участвует в генерации тирозильных радикалов. Молекулярный кислород в ходе ферментативной
реакции превращается в O- , для нейтрализации которого требуется СОД, и поэтому активность RR сохраняется только в присутствии суперок-сиддисмутазы [11] (рис. 1 — адаптировано из работы [11]).
Интенсивность свободнорадикального сигнала этого радикального фермента, регистрируемого ЭПР-методом в клеточных системах с высокой пролиферативной активностью и, в том числе, органах кроветворения, пропорциональна его каталитической активности и изучена нами в динамике при действии на организм ИИ разной мощности дозы и различных экзогенных генотокси-кантов [4, 5, 8, 16, 17]. Спектр ЭПР активной RR представляет собой дублет со значением сверхтонкого расщепления а = 20 Гс и g-фактором 2.005 и регистрируется при значении микроволновой мощности, равной 200 мВт. Образцы измеряли
Рис. 1. Модель фермента рибонуклеотидредуктазы (RR) из E. coli. (Адаптировано из работы [11]).
при 77 К на радиоспектрометре "ER-220D" фирмы "Вгакег" (Германия) с использованием стандартной методики накопления и анализа спектров на мини-ЭВМ "Азрес1>2000". Для контроля RR-активности использовали быстрозамороженные в жидком азоте образцы крови и ткани кроветворных органов. Подробное описание используемых методик приведено в монографии [4].
Фермент RR контролирует скорость-лимити-рующую стадию в синтезе ДНК — синтез 2'-дезок-сирибонуклеозид-5'-дифосфатов (dNDP), катализируя замещение ОН-группы в положении 2'рибозного остатка на атом водорода и образуя 2'-дезоксипроизводные. Ниже представлен метаболический путь включения рибонуклеозид-5'-дифосфатов (rNDP) в молекулу ДНК:
^то^^аз^мто ДНК-полимеразаДНК
Синтез dNTP строго контролируется ферментом RR, поскольку NDP-киназа не лимитирует скорость этой реакции. На этапе, катализируемом RR, обеспечивается сбалансированное поступление четырех dNTP (аденин-, гуанин-, ти-мин- и цитозин-содержащих) для синтеза и репарации ДНК, от велич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.