РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 634-638
РАДИОЭКОЛОГИЯ
УДК 574::539.1.04:57:539.12.08;615.849
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТИЛТЕТРАЗОЛИЙ БРОМИДА (МТТ) ДЛЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ НИЗКОДОЗОВОГО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМЕННОМ УРОВНЕ © 2013 г. Е. И. Сарапульцева1*, Н. И. Рябченко2, Ю. В. Иголкина1, Б. П. Иванник2
1Обнинский институт атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета "МИФИ" 2Медицинскийрадиологический научный центр Минздрава России, Обнинск
Впервые в исследовании in vivo на низших ракообразных рода Daphnia использован МТТ-тест, традиционно применяемый in vitro для тестирования лекарственных препаратов на цитотоксичность. В данной работе метод применен для изучения механизмов низкодозовых радиационных воздействий. МТТ-тест основан на анализе изменения показателя оптической плотности суспензии облученных гомогенизированных дафний, величина которого пропорциональна количеству формазана, образованного при восстановлении МТТ дегидрогеназами. Этот показатель определяет эффективность цитотоксического действия у-излучения, характеризуя изменение соотношения в организме нормальных и поврежденных клеток, а также подавление общей дегидрогеназной активности. Дафний облучали у-квантами 60Со. Показано значимое цитотоксическое действие у-излучения в дозах 100 и 1000 мГр. При этом между группами, дозы облучения которых отличались в 10 раз, значимого отличия в проявлении цитотоксичности у-квантов не выявлено. Сделано предположение, что снижение выживаемости, обнаруженное ранее при облучении дафний в дозах 100 и 1000 мГр, может быть связано с цитотоксическим эффектом излучения в клетках многоклеточного организма. Показана возможность использования дафний и МТТ-теста для целей биотестирования in vivo низко-дозового радиационного воздействия.
Ионизирующие излучения, малые дозы, МТТ-тест, дафнии. DOI: 10.7868/S0869803113060131
Для контроля загрязнения окружающей среды широко используют методы, основанные на оценке выживаемости Daphnia magna, продолжительности их жизни, поведенческих реакциях, репродуктивной активности и ряде других показателей [1—3]. Однако эти методики ранее не использовались для объяснения механизмов, лежащих в основе наблюдаемых реакций дафний на разные типы загрязнения.
В экспериментальных исследованиях, связанных с разработкой противоопухолевых химио-препаратов, а также других лекарственных средств, широкое распространение получили методики клеточного тестирования. Они позволяют оценить влияние исследуемых соединений на процессы клеточного метаболизма, в том числе генерацию активных форм кислорода (АФК), структуру ДНК и клеток, определить жизнеспособность и пролиферативную активность тестируемых клеток [4—7]. Для анализа цитотоксического действия химических соединений и излучений используют методы оценки проницаемости
* Адресат для корреспонденции: 249040 Обнинск, Калужская обл., Студгородок, 1, ОИАТЭ НИЯУ МИФИ, каф. биологии; тел.: (48439) 3-11-79, (48439) 7-08-22; e-mail: helen-bio@yandex.ru.
клеточных мембран к разным красителям, биохимические методы определения активности лак-татдегидрогеназы, которая переходит в окружающую среду при инкубации поврежденных клеток, флуоресцентные методы оценки целостности митохондрий, синтеза АТФ, генерации АФК и радикальных продуктов пероксидации липидов [8, 9]. Для анализа цитотоксичности многие исследователи уделяют особое внимание использованию водорастворимого 3 - (4, 5 -диметилтиазол- 2-ил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ) [10, 11]. Метод основан на способности митохон-дриальных дегидрогеназ восстанавливать проникающий в клетки МТТ с образованием нерастворимого формазана. Для растворения формазана обычно используют диметилсульфоксид (ДМСО) или изопропанол. Последующий фотометрический анализ позволяет сопоставить изменение оптической плотности раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток и оценить эффективность цито-токсического действия анализируемых соединений [12—14]. Во всех цитируемых работах показана высокая чувствительность МТТ-теста in vitro для оценки цитотоксичности противоопухолевых лекарственных препаратов. Вместе с тем в лите-
Эффективность (в ед. оптической плотности) в МТТ-тесте цитотоксического действия на дафнии ионизирующего излучения в разных дозах
Доза, мГр
Показатель 0 (Контроль) 100 1000
Число опытов (и) 10 15 10
Среднее арифметическое со стандартной ошибкой, 8.е.ш. 0.24 ± 0.01 0.16 ± 0.02 0.11 ± 0.01
ратуре не рассматривались вопросы использования МТТ-теста для биотестирования на организ-менном уровне in vivo химического или радиоактивного загрязнения окружающей среды.
В связи с этим целью настоящей работы стала оценка возможности использования низших ракообразных рачков рода Daphnia и МТТ-теста для целей биотестирования in vivo эффектов радиационного воздействия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Размножение Daphnia magna в лабораторных условиях осуществляется путем партеногенеза [15], что обеспечивает генетическую однородность популяций. Эмбриональный и постэмбриональный периоды длятся по 4—5 сут, период созревания 8—10 сут, репродуктивный период в условиях лаборатории до 2.5—3 мес. Полулетальная доза ионизирующей радиации (LD50/30) для ракообразных составляет около 50 Гр [16, 17]. Дафнии в нашей лаборатории культивируются около 10 лет.
МТТ-тест выполняли по методике, описанной в работах [18, 19] с небольшими модификациями. Односуточных рачков по 20 особей на пробу облучали на установке "Луч-1" (Латвия, 60Co) в дозах 100 мГр (мощность дозы 17 сГр/мин) и 1000 мГр (100 сГр/мин) в микропробирках типа Эппендорф в объеме 1.5 мл водопроводной дехлорированной воды. Эти дозы в десятки раз ниже, чем полулетальные для ракообразных. Контрольные пробы находились в тех же условиях, но без облучения. Через 1 ч после облучения проводили МТТ-тест. Для этого из микропробирок с облученными и контрольными дафниями удаляли воду, добавляли по 100 мкл раствора МТТ концентрацией 0.5 мг/мл в 0.9%-ном NaCl и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и дневном свете. По окончании инкубации су-пернатант осторожно удаляли, добавляли в каждую микропробирку по 100 мкл ДМСО ("Gaylord Chemical Company", Slidell, шт. Луизиана, США). Через 10 мин содержимое микропробирок гомогенизировали с помощью пестика. После растворения гранул формазана и, при необходимости,
краткого центрифугирования, супернатант переносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета ("Corning", Нью-Йорк, США). Для получения фоновых проб 40 особей необлученных 1-суточ-ных дафний гомогенизировали в 200 мкл ДМСО, пробы центрифугировали. МТТ не добавляли. По 100 мкл супернатанта переносили в лунки 96-лу-ночного планшета и фотометрировали при 545 нм.
Измерения оптической плотности окрашенных образцов проводили на планшетном имму-ноферментном анализаторе "StatFax" 2100 ("Awareness Technology", США, VIS-модель).
Оптическая плотность образов пропорциональна количеству формазана, образованного при восстановлении МТТ дегидрогеназами. Этот показатель характеризует эффективность цитотоксического действия (ЭЦД) у-излучения, суммируя изменение соотношения в организме нормальных и поврежденных клеток, а также подавление общей дегидрогеназной активности.
ЭЦД на дафнии ионизирующего излучения рассчитывали по формуле:
ЭЦД =
= {1 - [(ОПо - ОПф)/(ОПк - ОПф)]} X 100%,
где ОПо — оптическая плотность в облученном образце, ОПф — средняя оптическая плотность фоновых проб, ОПк — оптическая плотность в не-облученном контроле.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistic. Гомогенность внутри групп оценивали с помощью теста Крускелла—Уоллеса, значимость отличий от контроля оценивали непараметрическим критерием Манна—Уитни [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ гомогенности измеряемых показателей в каждой из контрольных и облученных групп дафний, но в разных повторах опытов, показал отсутствие статистически достоверной разницы по тесту Крускелла—Уоллеса (0.09 <р < 0.99), что
636
САРАПУЛЬЦЕВА и др.
Эффективность цитотоксического действия, %
601-
40
20
p = 0.1489
Контроль
100
1000 Доза, мГр
Рис. 1. Эффективность цитотоксического действия (ЭЦД, %) острого облучения дафний у-квантами в дозах 100 и 1000 мГр.
Доля выживших 1.0
Контроль 10 мГр 100 мГр 1000 мГр
J_I_I_L_
J_I_I_l_
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57
Возраст, сут
Рис. 2. Кривые выживаемости в необлученном контроле и в популяциях дафний, облученных в дозах 10, 100 и 1000 мГр. Приведены средние значения одного из экспериментов N = 40 в контрольной и в каждой из облученных популяций дафний из работы [22]).
0
0
позволило объединить результаты, полученные в разных повторах опытов в каждой группе.
Из представленных в таблице данных следует, что у дафний, облученных в дозах в 50 раз ниже полулетальных, показатели оптической плотности достоверно ниже, чем в контроле. Это свидетельствует об обусловленном действием излучения снижении дегидрогеназной активности в клетках дафний.
Из рис. 1 следует, что облучение в дозах 100 и 1000 мГр ведет к достоверному (р = 0.0099 и р = 0.0002 соответственно) увеличению относительной доли погибших клеток. Причем не было обнаружено достоверного различия ЭЦД между группами дафний, облученных в различающихся на порядок величин малых дозах (р = 0.1489).
ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами было показано снижение выживаемости дафний при облучении у-квантами в дозах 0.1; 1 и 20 Гр [17, 21] и снижение продолжительности жизни рачков при облучении в дозах 100 и 1000 мГр [22]. Реакция дафний на облучение в малых дозах, возможно, связана с увеличением синтеза и расхода АТФ. После облучения в мембранах митохондрий начинают развиваться деструктивные процессы, что приводит к снижению уровня ферментативной активности, общего уровня окислительного метаболизма, фосфори-лирования, а также к развитию общей патологии клеток [23, 24].
Согласно данным литературы, полученным в опытах in vitro, воздействие ионизирующей радиации, включая диапазон малых доз, вызывает ци-
тотоксический эффект [25, 26]. МТТ-те
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.