УДК 631.811.98:574.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ
СТИФУН*
© 2013 г. О.И. Яхин13, А.А. Лубянов13, И.А. Яхин1, Г.Б. Гареева1, Е.М. Маркелова1, Р.Р. Кабиров2, Г.М. Ханисламова2, А.И. Фазлутдинова2
1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН 450054 Уфа, просп. Октября, 71, Россия E-mail: yakhin@anrb.ru 2 Башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы 450000 Уфа, ул. Октябрьской революции, 3а, Россия 3Научно-производственное предприятие "Эко Природа " 452533 Республика Башкортостан, Дуванскийр-н, с. Улькунды, ул. Валеева, 33, Россия
Поступила в редакцию 08.11.2012 г.
Проведена экологическая оценка регулятора роста растений стифун с использованием многокомпонентной тест-системы. При его применении в концентрации 330 мг/л выявлена активация роста цианобактерии Synechocystis aquatilis, водорослей Chlorella vulgaris, Hantzschia amphioxys и инги-бирование - грибов Fusarium sp. и Bipolaris sorokiniana. Стифун не обладал генотоксическим эффектом на тест-объект Allium fistulosum и не оказывал негативного действия на Folsomia candida. Ключевые слова: регулятор роста растений стифун, многокомпонентная тест-система.
ВВЕДЕНИЕ
Живые организмы и экосистемы подвергаются воздействию целого ряда факторов антропогенного происхождения. Одним из таких негативных воздействий являются агрохимикаты и пестициды [1], которые могут оказывать токсическое действие на нецелевые объекты, проявляя гено-токсические, канцерогенные свойства [2], создавая риск повышения устойчивости к пестицидам в популяциях вредителей [3] и др. К этой группе также относят и регуляторы роста растений. Фи-торегуляторы характеризуются широкой зоной биологического действия [4]. Практическое применение синтетических и биогенных фиторегу-ляторов может создать проблему потенциальных негативных эффектов как для здоровья человека и окружающей среды [4], так и для самих растений - в аспекте отдаленных эффектов - последействия. Использование биологически активных препаратов может приводить к индуцированным сукцессиям в экосистемах [5]. Следует отметить, что в настоящее время в литературе имеется не-
* Исследования поддержаны Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе "Старт".
много работ, посвященных комплексной экологической оценке регуляторов роста. В связи с этим актуальным является изучение экологических аспектов применения регуляторов роста растений, что включает необходимость оценки их влияния на различные элементы экосистем.
Ранее было проведено биотестирование почвенного покрова городской территории [6], загрязненных нефтью почв [7], а также комплексная экологическая оценка техногенного воздействия на экосистемы южной тайги [8], предложены универсальные критерии для оценки экологического состояния почвенных альгоценозов [9], проведен анализ качественных и количественных характеристик сообществ почвенных диатомовых водорослей парковых экосистем с разной рекреационной нагрузкой [10]. Были сформулированы принципы составления, обоснован выбор объектов многокомпонентной тест-системы для решения задач биотестирования [6]. На основе предложенных подходов в настоящей работе применили данную систему с модификациями для биотестирования регуляторов роста растений. При составлении многокомпонентной тест-системы исходили из того, что для экстраполирования полученных в лабораторных условиях результатов на природные биоценозы и экосистемы в
нее должны быть включены прокариотические и эукариотические организмы, представители двух трофических уровней (автотрофы и гетеротро-фы), а также основных функциональных блоков наземных экосистем - продуценты, консументы, редуценты; в ее составе должны присутствовать представители основных царств живого - бактерии, грибы, растения, животные [6].
Одним из активно исследуемых в последние годы регуляторов роста является препарат сти-фун, представляющий собой лиофилизирован-ную форму экстракта Secale cereale [11]. Ранее на растениях пшеницы было установлено, что сти-фун вызывает существенные изменения гормональной системы [12] и метаболических процессов в растениях [13]. Наличие высокой биологической активности, неизученность потенциального риска для нецелевых организмов вызывает необходимость его экологической оценки.
Цель работы - использование многокомпонентной тест-системы, включающей в качестве объектов исследования бактерии, микроскопические водоросли, микроскопические грибы, высшие растения и беспозвоночных, для экологической оценки регулятора роста стифун.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали организмы, применяемые в биотестировании и обладающие высокой чувствительностью к внешним воздействиям. В состав многокомпонентной тест-системы входили: почвенная бактерия Pseudomonas sp., циано-бактерии Synechocystis aquatilis, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella vulgaris, диатомовые водоросли Hantzschia amphioxys, микроскопические грибы Fusarium sp. и Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, лук-батун (Allium fistulosum L.), овес посевной (Avena sativa L.) и ногохвостки (Folsomia candida).
Препаративную форму стифуна (водорастворимый порошок) получали по ранее описанной методике [11]. Тестируемые концентрации препарата: 3.3, 33 (концентрация, рекомендуемая для практического применения) и 330 мг/л. В экспериментах в качестве контроля использовали дистиллированную воду либо питательные среды без стифуна.
Бактерии Pseudomonas sp. культивировали в чашках Петри на мясо-пептонном агаре. Посев осуществляли однократно уколом материала из накопительной культуры в центр чашки. Агаровую среду готовили на соответствующей пита-
тельной среде с добавлением стифуна. Степень развития бактерий оценивали по изменению диаметра колонии.
Цианобактерии культивировали в жидкой питательной среде Бристоль [8]. Зеленые водоросли культивировали на среде Громова-6 [14]. Степень развития оценивали по численности клеток, которую измеряли на фотоэлектроколориметре по величине оптической плотности клеточной суспензии. Стифун вносили непосредственно в питательные среды.
Для исследования влияния стифуна на сообщество почвенных диатомовых водорослей в лабораторных экспериментах использовали почву, содержащую широко распространенные виды диатомей с высоким баллом обилия. Почву высушивали до воздушно-сухого состояния, измельчали, просеивали через сито с диаметром отверстий 3 мм и тщательно перемешивали. Исследование воздействия стифуна на морфологические и экологические особенности диатомовых водорослей проводили с использованием метода "стекол обрастания". В стерильные чашки Петри помещали по 40 г почвы с уже имеющимся пулом диатомовых водорослей. Стифун вносили в виде растворов разной концентрации, объем внесенного раствора составил 40 мл на чашку. Контрольный образец почвы увлажняли дистиллированной водой. По окончании 4-суточного инкубационного периода в каждую чашку помещали покровные стекла. Чашки Петри инкубировали в течение 4 нед в люминостате при комнатной температуре. Анализ стекол обрастания проводили через 7, 14, 21 и 28 сут экспозиции, отмечая степень обилия отдельных популяций диатомей, изменения в видовом составе и в комплексе доминантных видов при действии стифуна.
Культуру гриба Fusarium (в виде спор) получили из Ботанического института им. В.Л. Комарова (БИН). В пенициллиновые пузырьки добавляли несколько капель воды и высыпали споры для получения густой суспензии. 1 каплю такой суспензии наносили на поверхность агара в центр чашки Петри. Степень токсичности оценивали по изменению диаметра колонии через 3-5 сут инкубации в термостате при 25°С.
В тесте на генотоксичность семена лука-батуна (Allium fistulosum L.) сорта Грибовский, предварительно простерилизованные в 70%-ном этаноле, помещали в чашки Петри и проращивали на дистиллированной воде в течение 48 ч. Затем отбирали выровненные по размеру проростки и помещали их на растворы стифуна. Через 18 ч экспозиции растения фиксировали в растворе
этанол : уксусная кислота (3:1), через 1 сут их отмывали в проточной водопроводной, а затем в дистиллированной воде. Материал для цитологических препаратов брали из зоны деления корней [15]. Образцы отмывали от этанола водой 3 раза, отделяли корни и осуществляли гидролиз в 3 н. HCl при комнатной температуре 20 мин. Корни отмывали и переносили в 45%-ную уксусную кислоту на 10 мин, затем на 30 мин и снова, сменив кислоту, - на 3 ч. Для окрашивания материала использовали реактив Шиффа. Анализ ана-фазных пластинок проводили с использованием микроскопа Amplival ("Carl Zeiss", Германия).
Биотестирование стифуна также включало оценку его влияния на показатель всхожести семян Allium fistulosum L. и Avena sativa L. [6]. Опыт включал проращивание семян в чашках Петри на бумажных фильтрах, на которые помещали по 30 шт. семян исследуемых видов растений и приливали растворы биорегулятора.
Влияние стифуна на ногохвосток (Folsomia candida) проводили по методике, разработанной для лабораторной оценки токсичности загрязняющих почву соединений [7, 16]. В чашки Петри помещали по 15 г воздушно-сухой почвы (выщелоченный чернозем), протертой через сито диаметром 1 мм. Почву увлажняли 10 мл дистиллированной воды и уплотняли, затем в чашки вносили по 5 мл раствора стифуна. В каждую чашку Петри помещали по 10 особей ногохвосток старших возрастов из лабораторной культуры. Учет количества коллембол в опытах проводили через 1 ч, 12 ч и в последующем через каждые 24 ч в течение 10 сут.
Для обобщающей характеристики тестируемого биорегулятора и получения сопоставимых результатов использовали показатель индекса токсичности оцениваемого фактора (ИТФ) по методу [6], который рассчитывали по формуле ИТФ = ТФ0 : ТФк, где ТФ0 - величина регистрируемой тест-функции в опыте, ТФк - в контроле. Величина ИТФ изменяется от 0 до М, где М - любая положительная величина.
Эксперименты проводили не менее 3-х раз в трех-четырехкратной биологической повторно-стях. Статистическую значимость между вариантами оценивали с помощью t-критерия Сть
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.