МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 465-471
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК579.[841.11+873].0.17.8
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Н202 В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА КИСЛОРОДА БАКТЕРИЯМИ РОДОВ RSEUDOMONAS И RHODOCOCCUS
© 2004 г. А. Л. Тарасов, И. А. Борзенков, Е. И. Милехина, И. С. Мысякина, С. С. Беляев
Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 28.04.03 г.
Изучен рост бактерий рода Pseudomonas и Rhodococcus в присутствии перекиси водорода в качестве единственного источника кислорода. Установлено, что при концентрации H2O2 от 100 до 200 мкг/мл токсичное действие перекиси водорода проявляется в увеличение лаг-фаз роста культуры от 2 до 3 сут. Кроме токсичного действия перекиси рост бактерий ингибируется токсичным действием растворенного кислорода в концентрациях свыше 100 мкг 02/мл, которое может быть уменьшено присутствием углеводородной фазы в жидкости. Снижение парциального давления кислорода в присутствии углеводородов (12-15% по объему) приводило к инициации роста культуры при высоких начальных концентрациях H202 (300 мкг/мкл). При концентрациях перекиси водорода более 320 мкг/мл развития бактериальной культуры не происходило, независимо от количества внесенного углеводорода.
Ключевые слова: нефтеокисляющие микроорганизмы, перекись водорода, микробная биотехнология повышения нефтеизвлечения.
Рост аэробных микроорганизмов в природных условиях довольно часто происходит в условиях дефицита кислорода, и, вероятно, значительно реже при оптимальной его концентрации. Развитие аэробных бактерий в условиях избытка кислорода, т.е. его высокого парциального давления, как правило, наблюдается в искусственно создаваемых лабораторных условиях или в биотехнологических установках, осуществляющих, например, окисление алканов [1], ароматических углеводородов [2] и тетрахлорэтилена [3].
В различных модификациях биогеотехноло-гии повышения нефтеотдачи пластов подача кислорода в пласт осуществляется закачкой водно-воздушной смеси с использованием компрессоров высокого давления [4-6]. Технически это довольно сложная задача, поскольку давление в пласте часто выше давления, развиваемого компрессором. Кроме того, экономически не всегда оправданы затраты, связанные с подачей в пласт балласта в виде азота воздуха. Альтернативой компрессорной закачке воздуха могла бы стать подача в пласт кислорода в виде раствора перекиси водорода. Кислород, выделяющийся при разложении перекиси водорода, необходим на стартовой стадии микробиологических процессов, приводящих к повышению нефтеизвлечения в пласте.
Раствор перекиси водорода не является экзотическим реагентом при добыче нефти. В специальной литературе рассматривается возможность применения перекиси водорода в нефтяной промышленности с целью решения ряда технических
задач, к которым относятся тепловое воздействие на пласт, эффективное вытеснение нефти паром, плавление гидратов в подводном оборудовании, устранение загрязнений призабойной зоны и другие [7]. Разложение перекиси водорода и последующее окисление углеводородов при высоких температурах пласта может увеличить нефтеотдачу на месторождениях тяжелой нефти [8, 9].
Целью настоящей работы было изучить возможность роста аэробных микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды и карбоно-вые кислоты, при использовании H2O2 в качестве единственного источника кислорода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили с культурами Pseudomonas aeruginosa, штамм 202 и Rhodococcus erythropolis, штамм 367-6. R. erythropolis, штамм 367-6 был выделен из Бондюжского нефтяного месторождения [10], P. aeruginosa, штамм 202 - из морского нефтяного месторождения "Белый Тигр" (Вьетнам). Оба штамма используются в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения.
Для выращивания бактерий использовали модифицированную среду Раймонда следующего состава (г/л): NaCl - 5.0; NH4Cl - 1.0; MgCl2 ■ 6H2O -0.2; CaCl2 ■ 2H2O - 0.01; MnSO4 ■ 5H2O - 0.02; FeSO4 ■ 7H2O - 0.01; K2HPO4 - 0.04; mpuc - 2.0; CH3COONa - 1.4-2.0; дрожжевой экстракт "Difco" -1.0; pH 6.9-7.1.
мкг С/мл 80
70 60 50 40130 20 10
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Н202, мкг/мл
Рис. 1. Зависимость роста Я. erythropolis 367-6 от концентрации перекиси водорода при наличии воздушной фазы (1-суточная культура).
Флаконы объемом 14 или 20 мл полностью заполняли средой и закрывали резиновыми пробками, фиксированными алюминиевыми колпачками. Начальная оптическая плотность культуры составляла 0.04-0.06 при X = 540. Посевной материал, Н202 и другие добавки вводили во флаконы с помощью шприцев, не допуская появления пузырьков газа. Рост культур на ацетате измеряли с помощью радиоизотопного метода, по включению меченого углерода в биомассу клеток. В качестве метки использовали меченый по углероду метильной группы ацетат (удельная активность -49 гБк/г), который вносили в количестве около 0.1 мкКю на мл среды. По истечении определенного времени инкубации при 30°С из флаконов отбирали пробы культуральной жидкости объемом 0.5 мл, которые фильтровали через нитро-целлюлозные мембранные фильтры с размером пор 0.22 мкм. Биомассу на фильтрах дважды промывали изотоническим солевым раствором, высушивали и помещали во флаконы со сцинтилля-ционной жидкостью ЖС-106. Радиоактивность биомассы определяли на счетчике ЯаекЪйа, ЬКБ, Швеция.
Прирост биомассы на определенный момент времени в пересчете на 1 мл среды оценивали по количеству включенного в клетки углерода метильной группы ацетата, которое вычисляли по формуле:
Р = (г х Сац х ^ х Ме х 1000)/(К х V х Мац), мкг С/мл,
где К - активность углерода ацетата в среде, г -активность углерода в пробе на фильтре, Сац -
концентрация ацетата в среде, W - объем среды во флаконе, V - объем аликвоты, Мс - молекулярная масса углерода ацетата, Мац - молекулярная масса ацетата, 1000 - коэффициент пересчета мг на мкг. Предварительно было проведено сравнение результатов определения роста культур, полученных при измерении оптической плотности и радиоизотопным методом. Коэффициент корреляции по данным, полученным для разных стадий роста культуры P. aeruginosa, составил 0.98, что позволяет применять радиоизотопный метод для получения объективных данных по динамике роста.
При исследовании динамики роста бактерий пробу из флакона отбирали один раз, чтобы исключить влияние возможного изменения давления в сосуде. Количество кислорода, образующееся при разложении перекиси, вычисляли в соответствии с уравнением: 2H2O2 —► O2 + 2H2O.
В качестве углеводородной фазы во флаконы вводили стерильную смесь жидких парафинов сорта Парекс. Концентрацию кислорода в водной фазе вычисляли с учетом его растворимости в углеводородах. Для оценки растворимости кислорода в парафинах и нефти определяли объем кислорода, растворяющегося в объеме парафина (или нефти) при нормальных условиях. Для дегазации аликвота парафинов была предварительно вакуумирована в течение 15 мин. Объем кислорода, поглощенного парафином, измеряли с помощью калиброванного шприца.
Анализ жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии после их экстракции и метанолиза. Жирные кислоты (ЖК) экстрагировали из углеводородной фазы щелочным раствором (0.05 N NaOH), который потом подкисляли HCl до pH 5 и ЖК экстрагировали гексаном. Метиловые эфиры жирных кислот получали кислым метанолизом с использованием раствора хлористого ацетила в метаноле при 80°C в течение 1.5 ч [11], экстрагировали гексаном и анализировали на газожидкостном хроматорафе модели 3700 (Россия) с плазменно-ионизационным детектором. Твердая фаза - диэтиленгликольсукцинат (15%) на хромосорбе W (40-60 меш), режим - изотермический с температурой 180°C, газ-носитель - аргон (40 мл/мин). В качестве стандартов использовали метиловые эфиры жирных кислот с длиной цепи от 8 до 18 углеродных атомов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Предварительные эксперименты по влиянию H2O2 проводили в присутствии газовой фазы в закрытых флаконах на 20 мл с 5 мл среды, засеянной культурой R. erythropolis 367-6. В течение первых суток развитие культуры наблюдали при концентрациях H2O2 до 300 мкг/мл (рис. 1). При более высоких концентрациях H2O2 рост культу-
мкг С/мл 35
30 25 2015 10 5
s2 \
\
\
100 200 300 400 500 600
H2O2, мкг/мл
Рис. 2. Зависимость роста R. erythropolis 367-6 (1) и P. aeruginosa 202 (2) от концентрации перекиси водорода при наличии воздушной фазы (1-суточная культура).
мкг С/мл 30
25 20 15 10 5
сут
Рис. 3. Динамика роста R. erythropolis 367-6 при различных концентрациях перекиси водорода: 1 - без H2O2, 2 - 103 мкг/мл H2O2, 3 - 145 мкг/мл H2O2, 4 -207 мкг/мл H2O2, 5 - 310 мкг/мл H2O2.
4
0
ры начинался позже. Наличие газовой фазы может повысить концентрационный порог токсичности перекиси водорода в среде из-за равновесного перераспределения свободного кислорода между фазами. Поэтому следующие эксперименты были поставлены в сосудах, полностью заполненных жидкостью. В этих условиях рост культур P. aeruginosa 202 и R. erythropolis 367-6 был ограничен концентрациями H2O2 около 220 мкг/мл (рис. 2).
При исследовании динамики роста R. erytropolis было показано, что с увеличением концентраций H2O2 от 100 до 200 мкг/мл происходило удлинение лаг-фазы от 2 до 3 сут (рис. 3). Это свидетельствует о возрастании токсического воздействия перекиси на клетки. В то же время конечный урожай клеток в вариантах с концентрацией перекиси от 100 до 200 мкг/мл соответствует вносимому количеству перекиси, т.е. конечный выход биомассы, по-видимому, лимитирован запасом кислорода во флаконе. В случае, когда концентрации перекиси превышали 300 мкг/мл H2O2, рост культур не наблюдался. Увеличение лаг-фазы и одновременно урожая клеток позволяет предполагать, что в диапазоне концентраций H2O2 от 100 до 200 мкг/мл происходило отмирание части клеточной популяции в течение непродолжительного периода разложения перекиси (2-3 ч). Оптимальные концентрации перекиси водорода для начала роста, очевидно, значительно ниже 100 мкг/мл, что соответствует примерно 50 мкг O2/мл. По литературным данным, такие концентрации кислорода, соответст-
вующие парциальному давлению более 1 атм, должны значительно с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.