УДК 602.68:616.127-005.8-07
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФРАГМЕНТОВ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОПОНИНА I*
© 2012 г. Е.П. Альтшулер1**, А.В. Вылегжанина2, И.А. Катруха1, А.В. Березникова1, Д.В. Серебряная1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-1474, электронная почта: eugeny.altshuler@gmail.com 2 ООО «Биалекса», 117149 Москва, Симферопольский б-р, 8
Поступила в редакцию 27.08.12 После доработки 10.09.12
Изоформа тропонина I, экспрессируемая в сердце человека (ИеТпГ), является надежным маркером повреждений кардиомиоцитов, сопровождающих такое распространенное заболевание, как инфаркт миокарда. Моноклональное антитело 19С7 обладает способностью узнавать ИеТп1 с высокой аффинностью и специфичностью и может быть использовано при создании диагностических систем для количественного определения ИеТп1 в крови больных. В данной работе было проведено сравнение полноразмерного монокло-нального антитела 19С7 и его рекомбинантных фрагментов, и было показано, что рекомбинантные аналоги обладают сходной с полноразмерным антителом аффинностью и могут быть использованы в системах детекции ИеТп1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, тропонин I, аффинность, флуороиммунный анализ, биотинилирование.
Сердечно-сосудистые заболевания на протяжении многих десятилетий остаются главной причиной смертности в индустриально-развитых странах. По данным ВОЗ, в 2008 г. сердечно-сосудистые заболевания привели к смерти 17,3 млн человек, что составило около 30% всех летальных исходов в мире. Из них 6,2 млн человек умерли от инфаркта миокарда.
Изоформа тропонина I, экспрессируемая в сердце человека (ИеТп1), считается одним из наиболее ранних и специфичных биомаркеров повреждения кардиомиоцитов. Уже на протяжении двух десятилетий ИеТп1 активно используют для диагностики таких сердечно-сосудистых заболеваний, как инфаркт миокарда и нестабиль-
ная стенокардия; и для оценки риска возникновения и развития осложнений, связанных с данными патологиями [1—4]. Выбранное нами для исследования моноклональное антитело 19C7 (MAb 19C7) с высокой аффинностью и специфичностью взаимодействует как со свободной молекулой hcTnl, так и с hcTnl, находящимся в составе двойного (IC) или тройного (ITC) комплексов из субъединиц — I, Т и С соответственно. Связывание MAb 19С7 с антигеном также не зависит от возможных посттрансляционных модификаций hcTnI, таких как фосфорилирование и частичный протеолиз. Показано, что MAb 19C7 может быть использовано в парах с монокло-нальными антителами, специфичными к дру-
Принятые сокращения: BITC — биотинизотиоцианат; eFab — Fab фрагменты моноклонального антитела 19C7, полученные путем ограниченного протеолиза полноразмерных антител под действием папаина; hcTnl — изоформа тропонина I, экспрессируемая в сердце человека; IC и ICT — двойной и тройной тропониновый комплекс из субъединиц I, Т и С соответственно; MAb — моноклональное антитело; MPB — малеимид-ПЭГ11-биотин; MAb 19C7-BITC — моноклональное антитело 19С7, биотинилированное с использованием биотинизотиоцианата (BITC); rAb — рекомбинантное антитело; rFab — рекомбинантные Fab-фрагменты MAb 19C7; scFv — одноцепочечные фрагменты MAb 19С7, состоящие из вариабельных доменов его легкой и тяжелой цепей, соединенных глицин-сериновым линкером; scFv-BITC — scFv-фрагменты MAb 19C7, биотинилированные с использованием биотинизотиоцианата (BITC); scFv-MPB — scFv-фрагменты MAb 19C7, биотинилированные с использованием малеимид-ПЭГ1Гбиотина (MPB); ФИА — флуороиммунный анализ.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 12-242, 30.09.2012.
** Адресат для корреспонденции.
1653
гим эпитопам hcTnl, для создания диагностических систем для количественного определения этого белка [5—7].
Рекомбинантные аналоги моноклональных антител (rAb) — полноразмерные рекомбинантные антитела или их фрагменты — все чаще используются для создания диагностических систем. К преимуществам rAb в сравнении с антителами, получаемыми гибридомным методом, можно отнести, прежде всего, возможность внесения в структуру антитела различных модификаций. Использование точечных мутаций в вариабельной области антитела позволяет существенно повысить аффинность его взаимодействия с антигеном, что, как правило, приводит к увеличению чувствительности диагностической системы. Возможность вносить изменения в структуру рекомбинантных антител позволяет производить ориентированную иммобилизацию антител при проведении твердофазного иммуноанализа. Ориентированная посадка антитела на поверхность позволяет добиться максимальной удельной активности антител, что, в свою очередь, в некоторых случаях также может позволить повысить чувствительность систем. Использование в диагностических системах химерных полноразмерных антител с мышиными вариабельными доменами и человеческими константными участками, а также использование рекомбинантных Fab-фрагментов антител позволяет устранить ложноположительные результаты тестирования образцов, содержащих так называемые HAMA (human anti-mouse) антитела — человеческие антитела, специфичные к константным участкам антител мыши [8, 9]. Таким образом, и чувствительность диагностических систем, и достоверность полученных результатов в системах с использованием реком-бинантных антител может быть выше, чем в системах, в которых используются аналогичные моноклональные антитела [10].
В данной работе было проведено сравнение основных биохимических и иммунохимических свойств антитела 19С7 и его рекомбинантных фрагментов. Были получены рекомбинантные моновалентные Fab-фрагменты, а также одно-цепочечные scFv-фрагменты MAb 19С7, состоящие из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела, соединенных глицин-серино-вым линкером; был проведен сравнительный анализ рекомбинантных фрагментов и исходного антитела. Рекомбинантные фрагменты, а также антитела дикого типа использовали в качестве антител, сорбируемых на твердую фазу для создания систем для количественного определения hcTnl в сыворотках больных с диагнозом «острый инфаркт миокарда».
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение молекулярно-генетических конструкций. В качестве источника генетического материала была использована гибридомная клеточная линия, секретирующая MAb 19C7 [5]. С помощью обратной транскрипции с использованием о^о(ёТ) праймеров и обратной тран-скриптазы M-MLV («Силекс М», Россия) была получена кДНК, которую впоследствии использовали в качестве матрицы для ПЦР. Нуклео-тидная последовательность, соответствующая Fab- и scFv-фрагментам генов, была оптимизирована для лучшей экспрессии в клетках E. coli. Для последующей экспрессии фрагменты были встроены в векторы pET23a+ и pET22b+ («Novagen») по рестрикционным сайтам Ndel и XhoI. Для получения Fab-фрагментов были созданы две плазмиды, кодирующие легкую цепь и фрагмент тяжелой цепи MAb 19C7 (pET23a+/ /FabLC и pET23a+/FabHC соответственно). При конструировании плазмиды pET22b+/scFv для получения scFv-фрагментов вариабельные домены легкой (VL) и тяжелой цепи (VH) были соединены глицин-сериновым линкером с образованием конструкции VL-(Gly4Ser)3-VH.
Экспрессия белков в клетках E. coli. Экспрессию рекомбинантных фрагментов проводили в клетках E. coli штаммов BL21(DE3)pLysS и Rosetta(DE3) («Novagen»). Для этого трансформированные плазмидами клеточные культуры наращивали до оптической плотности 0,4—0,5 при длине волны 600 нм в среде LB Miller («Amresco»), после чего индуцировали экспрессию белка добавлением изопропил^^-1-тио-галактопиранозида до конечной концентрации
3 мМ. Затем клеточные культуры инкубировали
4 ч при температуре +37° при интенсивном перемешивании, после чего центрифугировали 25 мин при 3000 g при 4° для получения клеточного осадка.
Получение иммунохимически-активных рекомбинантных фрагментов антител. Функционально-активные фрагменты антител получали из фракции телец включения, в которых реком-бинантные фрагменты накапливались в нерастворимой форме. Ренатурацию белка из телец включения проводили по методу Wibbenmeyer [11] с модификациями. Для этого клеточный осадок после экспрессии лизировали путем обработки ультразвуком («Branson Digital Sonifier», Model 250) в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ фенилметил-сульфонилфторид, Triton-X100 2% (по объему). Фракцию телец включения получали c помощью центрифугирования полученной суспензии 30 мин при 25 000 g при 4°. Осадок, со-
держащий тельца включения, дважды отмывали от белков растворимой фракции в том же буфере и центрифугировали при тех же условиях. Затем тельца включения дважды отмывали от Triton Х-100, используя аналогичный буфер, не содержащий Triton Х-100. Осадок телец включения растворяли в минимальном объеме солюби-лизирующего буфера (6 М гуанидинхлорид, 0,1 М аргинин, 2,5 мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0) в течение 25 мин при 37° и постоянном перемешивании. Для удаления нерастворенных белков полученную суспензию центрифугировали 25 мин при 25 000 g при 4°.
При получении рекомбинантных Fab-фраг-ментов легкую цепь и фрагмент тяжелой цепи MAb 19C7 экспрессировали раздельно. Затем легкие цепи и фрагменты тяжелой цепи смешивали в эквимолярном количестве, добавляли Р-меркаптоэтанол до концентрации 50 мМ для восстановления дисульфидных связей и инкубировали в течение 1 ч при 37° и постоянном перемешивании. После инкубации раствор разбавляли буфером ренатурации (6 М гуанидинхлорид, 0,1 М аргинин, 2,5 мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, и 4 мМ окисленный глутатион) до концентрации белка 0,2 мг/мл, инкубировали в течение 24 ч при температуре 25° и постоянном перемешивании, а затем диализовали при 4° против 10-кратного объема диализного буфера, содержащего 0,1 М аргинин, 2,5 мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, в течение 24 ч. На следующем этапе раствор фрагментов диализовали против буфера, содержащего 2,5 мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, в течение 24 ч, после чего переводили в буфер, содержащий 150 мМ NaCl, 0,1%-ный
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.