ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 10, с. 1361-1368
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 575.224:582.282.23
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ АДАПТИВНОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАННИХ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ de novo МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Pichia methanoliea MH4
© 2009 г. Т. А. Дутова, Н. Н. Мордкович, Ю. Д. Цыганков
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 113545; e-mail: t_dutova@genetika.ru Поступила в редакцию 25.09.2008 г.
У метилотрофных дрожжей Pichia methanolica получена коллекция спонтанных "романовских" мутантов (1654 шт.) по ранним генам биосинтеза пуринов PUR1-PUR5 от 16 исходных ade1(pur6) и ade2(pur7) штаммов. Ранее были идентифицированы два гена - бифункциональный ADE7,4(PUR2,5) и ADE5(PUR4). Для идентификации двух оставшихся ранних генов (ADE3 и ADE8) был применен новый подход: сопоставление спектров спонтанных "романовских" мутантов с относительными размерами генов (по длине полипетпидов в аминокислотных остатках, а.о.).
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae нами была выявлена значительная корреляция между относительными размерами генов и долей мутантов в спектре (анализ литературных данных). Данные по усредненной длине полипептидных продуктов генов пяти ранних стадий биосинтеза пуринов 22 видов низших эукариот были получены с использованием базы данных (PubMed). Для дрожжей P. methanolica нами также была выявлена корреляция между спектром спонтанных "романовских" мутантов и относительными размерами генов. На этом основании ген ADE3 был идентифицирован как PUR1, а ген ADE8 как PUR3.
Спонтанный мутагенез, приводящий к появлению "романовских" мутантов, вероятнее всего, связан с транскрипционной активностью ранних генов, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными о корреляции спектра мутантов с размерами генов. Высказано предположение, что в основе эффекта Roman может лежать адаптивный мутагенез - усиление транскрипции ранних генов в ответ на стресс, накопление токсичных метаболитов (АИР или КАИР) при блоке 67-й стадии биосинтеза пуринов.
Большинство организмов обладают способностью к биосинтезу пуриновых нуклеотидов (БПН) de novo. Путь БПН консервативен у всех организмов, за исключением некоторых паразитических форм про- и эукариот, и включает 10 последовательных этапов до инозинмонофосфата (ИМФ) (рис. 1). Однако организация генов, контролирующих БПН, и их регуляция значительно различаются у разных видов и остаются предметом интенсивного изучения [1].
У дрожжей наиболее изучены гены ADE2 (PUR6) и ADE1 (PUR7), контролирующие 6-й и 7-й этапы БПН, кодирующие соответственно АИР-карбоксилазу и САИКАР-синтетазу. Дрожжи, мутантные по этим генам, образуют красные колонии в результате накопления в клетках пигмента - продукта полимеризации АИР или КАИР [2]. Система учета и отбора прямых мутантов ade2 (pur6) или adel (pur7) по фенотипу "от белого к красному" нашла широкое применение в генетических исследованиях дрожжей. Гораздо менее изучена и распространена другая система визуального отбора прямых мутантов на неселектив-
ной среде, получившая название "от красного к белому", где в качестве исходных штаммов служат мутанты pur6 или pur7. Известно, что у красных аденинзависимых мутантов S. cerevisiae мутации в любом из генов пяти ранних стадий биосинтеза пуринов (PUR1-PUR5) приводят к восстановлению белой окраски колоний, тогда как блокирование более поздних этапов биосинтеза пуринов не влияет на пигментацию. В 1956 г. Roman описал у S. cerevisiae эффект селективного преимущества таких двойных ауксотрофов, спонтанно возникающих в виде мелких белых колоний на поверхности красной колонии одиночного ауксотрофа при инкубации на полной среде [3]. Генотип спонтанных мутантов соответствует ade2(pur6) purx либо ade1(pur7) purx, где х - мутация PUR1-PUR5 генов. Тест-система учета прямых мутаций для другого вида дрожжей Schizosaccaromyces pombe, использующая мутационную систему Roman, разработана Loprieno на основе радиочувствительного штамма [4]. В усовершенствованной тест-системе S. cerevisiae для изучения процессов индуцированного мутагенеза используют делеционные мутанты
Aade2(pur6), чтобы исключить возникновение реверсий и вести отбор по цвету только прямых мутантов по ранним PUR1-PUR5 генам в рассевах красных колоний на полной среде [5].
Ранее у метилотрофных дрожжей Pichia meth-anolica в нашей лаборатории были получены индуцированные ade-мутанты, которые после проведения комплементационного и тетрадного анализа были отнесены к семи независимым генам ADE1-ADE7 [6, 7]. Два гена, мутанты по которым накапливали красный пигмент, генетическими и биохимическими методами были идентифицированы как ADE1(PUR6) и ADE2(PUR7) [7]. У нескольких мутантов ade1(pur6) и ade2(pur7) P. methanolica был обнаружен эффект Roman (ЭР) и получена коллекция спонтанных "романовских" мутантов по ранним генам биосинтеза пуринов. Анализ коллекции с использованием тестеров по генам ADE1-ADE7 определил три ранних гена биосинтеза пуринов: ADE3, ADE5 и ADE7,4. Дополнительно были выявлены спонтанные мутанты еще по одному гену, обозначенному как ADE8 [8]. Впоследствии были идентифицированы два ранних гена генетическими, биохимическими и молекулярно-генетическими методами: ADE7,4 как бифункциональный ген PUR2,5 и ADE5 как PUR4 [9, 10].
В настоящей работе проведена идентификация двух оставшихся ранних генов - ADE3 и ADE8 дрожжей P. methanolica на основании нового подхода с использованием баз данных по генам PUR1-PUR5 у разных видов грибов и анализа спектра "романовских" мутантов. Обсуждается природа ЭР у дрожжей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Среды. Составы полной среды YEPD, минимальной М, селективных AL-5 приведены в [6, 8]. Для штаммов, имеющих дополнительные ауксо-трофности, в среду М вносили кроме аденина аргинин или гистидин в концентрациях 20 мг/л. Для увеличения эффективности скрещивания использовали среду Мал-3, вариант среды М, с заменой глюкозы на 3%-ную мальтозу.
Штаммы. Исходные штаммы и тестеры для получения и идентификации коллекции "романовских" мутантов представлены в табл. 1. Часть коллекции (375 шт.) "романовских" мутантов была проанализирована нами ранее, причем два исходных штамма с мутациями ade1-4 и ade2-3 проявляли максимальный ЭР [8]. Общая выборка полученных нами мутантов составила 1654 шт. Для идентификации полученных в настоящей работе спонтанных мутантов использовали набор тестеров P. methanolica по генам ADE1-ADE7 [6-8]. Тестерами служили одиночные мутанты МН4-16 и МН4-81 и спонтанные "романовские" мутанты
5,10-метилен-ТГФ
ADE3 10-формил-ТГФ
ФРПФ
I ADE4 ФРА
„ ADE5,7 ГАР
ADE8 ФГАР
ADE6
ФГАМ
ADE5,7 АИР -
"ADE2 Образование красного пигмента в вакуоле
КАИР -
-ADE1 САИКАР
ИМФ
Рис. 1. Схема биосинтеза пуринов de novo у дрожжей Saccharomyce cerevisiae. Аббревиатура, интермедиаты и гены: ФРПФ - 5'-фосфорибозил-1-пирофосфат; ФРА -5'-фосфорибозил-1-амин; ГАР - 5'-фосфорибозилглици-намид; ФГАР - 5'-фосфорибозил^-формилглицинамид; ФГАМ - 5'-фосфорибозил^-формилглицинамидин; АИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол; КАИР -5'-фосфорибозил-4-карбокси-5'-аминоимидазол; САИКАР - 5'-фосфорибозил-4-^-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол; ИМФ - инозинмонофосфат; гены: ADE4 - фосфорибозилпирофосфат амидотрансфераза; ADE 5,7 - глицинамид риботид синтетаза и аминоимида-зол риботид синтетаза; ADE8 - глицинамид риботид трансформилаза; ADE6 - 5'-фосфорибозил-формилг-лицинамид-синтетаза; ADE2 - фосфорибозиламино-имидазол-карбоксилаза; ADE1 - фосфорибозил-ами-но-имидазол-сукцинокарбозамидсинтетаза.
или их одиночные сегреганты такие, как МН4-34, МН4-196, МН4-762 и МН4-785.
Получение мутантов. Методы отбора по Roman двойных спонтанных аденинзависимых мутантов с модификациями подробно описаны ранее [8]. Для идентификации полученных мутантов их скрещивали с набором тестеров. Для повышения эффективности скрещивания использовали среду Мал-3, что облегчало отбор прото-трофных гибридов на среде М. Сравнение белковых продуктов ранних генов PUR1-PUR5 у 22 видов дрожжей и грибов проведено с использованием базы данных PubMed. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Protein).
Таблица 1. Генотипы исходных и тестерных штаммов P. methanolica
Исходные штаммы Генотип Штаммы-тестеры Генотип
MH4-1 ade1-1 MH4-16 ade3-16
MH4-3 ade2-3 MH4-34 ade8-34s
MH4-4 ade1-4 MH4-81 ade4-81
MH4-5 ade1-5 MH4-199 ade1-1 ade7-199s
MH4-6 ade1-6 MH4-612 ade2-3 ade7,4s
MH4-17 ade1-17 MH4-615 ade 1-17 ade7,4-615s
MH4-19 ade1-19 MH4-617 ade 1-17 ade7-617s
MH4-162 mat а 46 ade2-3 MH4-622 ade 1-17 ade4-622s
MH4-642 ade2-3 arg2 MH4-623 ade 1-17 ade4-623s
MH4-670 ade2-3 his4 MH4-628 ade1-19 ade7,4-628s
МН4-763 ade1-4 his4 MH4-630 ade 1-5 ade8-630s
МН4-764 ade1-4 his1 MH4-762 ade5-631s
MH4-931 mat а 46 ade1-4 MH4-785 ade7,4-628s
MH4-2057 ade1-2057 arg1 MH4-779 ade7-196s
MH4-2063 ade1-2063 arg1
MH4-2065 ade1-2065 arg1
Примечание. s - спонтанная мутация.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для идентификации генов ADE3 и ADE8 дрожжей P. methanolica нами был разработан и использован новый подход на основе сравнения спектров спонтанных "романовских" мутантов и размеров генов (сумма аминокислотных остатков в полипептиде, а.о.), контролирующих пять ранних стадий биосинтеза пуринов.
У дрожжей сахаромицетов неоднократно отмечали сдвиг в спектре индуцированных и спонтанных мутантов по паре генов ADE1(PUR7) и ADE2(PUR6) в сторону мутантов ade2, что согласуется с большим размером гена ADE2(PUR6) по сравнению с геном ADE1(PUR7) (размеры полипептидов 571 и 306 а.о.) [11-14]. Опираясь на предположение, что спектр прямых мутаций может отражать размеры генов, были проанализированы литературные данные для S. cerevisiae по ранним генам PUR1-PUR5, включающие как спектры спонтанных "романовских" мутантов, так и данные по длине полипептидных продуктов соответствующих генов.
В период 1956-1972 гг. в четырех разных лабораториях были получены коллекции "романовских" мутантов от трех независимых исходных культур, общая выборка которых составила 2878 мутантов [3, 15-17].
Размеры полипептидов ранних генов биосинтеза пуринов для дрожжей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.