ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 8, с. 895-904
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ ^
УДК 633.494:631.527
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ FAD3 У РАПСА (Brassica napus L.)
© 2015 г. В. А. Лемеш1, Г. В. Мозгова1, З. Е. Грушецкая1, Е. В. Сидоренко1, Я. Э. Пилюк2, А. В. Бакановская2
Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072
e-mail: G.Mozgova@igc.bas-net.by 2Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по земледелию, Жодино 222160
Поступила в редакцию 29.09.2014 г.
Проведен поиск аллелей, ответственных за качество рапсового масла пищевого назначения, в коллекции 21 образца ярового и озимого рапса белорусской и российской селекции, а также разработка A- и C-геном-специфичных ДНК-маркеров для оценки геномного полиморфизма рапса по генам FAD3 и отбор растений с низким содержанием линоленовой кислоты для вовлечения их в селекционный процесс. Разработка способа идентификации аллелей генов FAD3, контролирующих уровень содержания линоленовой кислоты в масле семян рапса, а также создание новых dCAPS маркеров позволили идентифицировать в поколениях F2 индивидуальные растения, гомозиготные по генам FAD3A и/или FAD3C. В настоящее время данные образцы вовлечены в селекционный процесс создания новых сортов со сниженным содержанием линоленовой кислоты в рапсовом масле.
DOI: 10.7868/S0016675815080044
Качество рапсового масла определяется содержанием входящих в его состав жирных кислот [1], которые представлены высокомолекулярными ненасыщенными кислотами — олеиновой (C18:1), ли-нолевой (C18:2), линоленовой (C18:3). Стандартное рапсовое масло содержит 50—60% олеиновой, 18—22% линолевой и 12—15% линоленовой кислот [1, 2]. Одним из основных направлений селекции масличного рапса пищевого назначения является снижение уровня линоленовой кислоты до 2—4% и повышение содержания олеиновой кислоты до 80% в рапсовом масле, что приведет к снижению скорости окисления масла и улучшению его качественного состава.
Высокоолеиновые и низколиноленовые формы рапса были созданы с помощью мутагенеза [3, 4]. Установлено, что содержание олеиновой кислоты контролируется основным геном FAD2 (fatty acid desaturase 2), который кодирует фермент эндо-плазматическую дельта-12-олеатдесатуразу. Данный фермент отвечает за дегидрирование олеиновой кислоты до линолевой [5, 6]. Scheffler et al. [7] картировали четыре локуса гена FAD2 на четырех различных группах сцепления, две из которых принадлежат геному A (Brassica rapa) и две — геному C (Brassica oleracea). К настоящему времени установлено, что функциональные копии гена FAD2 принадлежат группе сцепления N5 генома А
[7, 8].
Генетический анализ картирующей популяции от скрещивания мутанта с уровнем линоленовой
кислоты 3% и сортом Drakkar (9—10%) показал, что низкий уровень линоленовой кислоты контролируется двумя главными QTL-локусами — L1 и L2 с аддитивным эффектом [9]. Два локуса, контролирующие содержание линоленовой кислоты, соответствуют двум генам FAD3 (fatty acid desaturase 3), кодирующим эндоплазматическую дель-та-15-линолеатдесатуразу, которая отвечает за дегидрирование линолевой кислоты до линолено-вой. Один из генов локализован в A-геноме (B. rapa), а другой — в C-геноме (B. oleracea) рапса [9, 11]. Yang et al. [10] установили, что однонук-леотидные замены в BnaA.FAD3b и BnaC.FAD3.b также могут приводить к реализации фенотипа с низким содержанием линоленовой кислоты.
Известно, что однонуклеотидная мутация (замена С на Т) по гену FAD2 генома А приводит к увеличению содержания олеиновой кислоты. В результате мутации формируется стоп-кодон (TAG), вследствие чего наступает преждевременная терминация синтеза пептидной цепи. Предполагается, что такой укороченный полипептид не функционирует, и дегидрирование олеиновой кислоты не происходит, что приводит к ее накоплению в мутантных линиях. В исследованиях Hu et al. [2] и Micolaiczyk et al. [12], проводимых на разных мутантных линиях озимого и ярового рапса, были выявлены однонуклеотидные мутации — транзиция С на Т в седьмом экзоне мутантного аллеля FAD3A гена, которая приводит к замене аминокислоты аргинин на цистеин, и транзиция
Таблица 1. Аллель-специфические праймеры, использованные для идентификации аллелей генов ЕЛБЗА и ГЛОЗС
Праймер Последовательность (5'—3') Длина амплифицируемого фрагмента, пн
LinAR AATCTCTATCAATAGTTGTTAATCCTCCAG 339
LinAF CTCGTTGGTCCAGTCACAGTTCTAA
LinCR CGTGAGTTCCAATATCGTGATGA 210
LinCF ATGGTCACGATGATAAGCTGCCTTGGTACAGAGGCCAG
О на А в 5'-донорном сайте сплайсинга шестого интрона мутантного аллеля гена ЕЛБЗС [2, 12]. Установлена достоверная корреляция между мутациями в геномах А и С и снижением уровня содержания линоленовой кислоты в масле семян рапса [12].
Идентификация генотипов с высоким содержанием олеиновой и низким — линоленовой ненасыщенных жирных кислот в масле семян является одной из задач современной селекции рапса. Создание молекулярных маркеров к генам, контролирующим признаки со сложной природой наследования, таким как содержание ненасыщенных жирных кислот, повысит информативность оценки данных признаков и позволит с высокой эффективностью проводить отбор по аллелям, определяющим данные хозяйственно ценные признаки, в больших селекционных популяциях, что значительно сократит сроки создания новых селекционно-ценных сорто-образцов и сортов.
Целью исследования являлась разработка эффективных А- и С-геном-специфичных ДНК-маркеров для оценки геномного полиморфизма рапса по генам, определяющим качество рапсового масла пищевого назначения, детекция аллелей, контролирующих повышенное содержание олеиновой и пониженное — линоленовой ненасыщенных жирных кислот в коллекции сортов, сортообразцов и сортолинейных гибридов ярового и озимого рапса белорусской и российской селекции, отбор форм с низким содержанием лино-леновой кислоты и вовлечение их в селекционный процесс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служила коллекция, включающая 21 образец: сорта ярового и озимого рапса белорусской и российской селекции, сортолинейный гибрид и сортообразец белорусской селекции (см. табл. 2).
Для отбора селекционного материала по аллелям генов ¥ЛБ2 и ¥АБ3С, контролирующим повышенный уровень содержания олеиновой и пониженный — линоленовой кислоты в масле, использованы ДНК-маркеры согласно [2]. ПЦР
проходила в 25 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер (650 мМ Трис-HCl, 166 мМ (NH4)2SO4, 0.2% твин-20, pH 8.8), 0.25 мкМ каждого праймера, 1 мкМ dNTP, 2.5 (l.5) мМ MgCl2, 1 U Taq-полимеразы и 100 нг тотальной ДНК. Параметры амплификации для детекции мутантного аллеля гена FAD2: денатурация — 94°C 4 мин; 30 циклов - 94°C 30 с, 62°C 30 с, 72°C 30 с; заключительная элонгация — 72°C 30 мин; для детекции мутантного аллеля FAD3C гена: денатурация — 94°C 4 мин; 14 циклов — 94°C 30 с, 62°C 30 с, 72°C 30 с (с понижением температуры отжига прайме-ров на 0.7°C в каждом цикле); 20 циклов — 95°C 30 с, 52°C 30 с, 72°C 30 с; заключительная элонгация — 72°C 7 мин. Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 0.8%-ном ага-розном геле.
Для дифференциации аллелей генов FAD3A и FAD3C использована предложенная нами методика двухступенчатой реакции амплификации с помощью специфической пары праймеров Fad3AR и Fad3CF [12]. Кроме них в первый этап амплификации также были включены специально созданные нами праймеры LinAF и LinCR [13] к фрагментам геномной ДНК (А- и С-геном рапса). На втором этапе для детекции аллелей генов FAD3 использованы разработанные нами dCAPS-прай-меры: LinAF и LinAR для А-генома рапса и LinCF и LinCR — для С-генома рапса [13]. Последовательности праймеров представлены в табл. 1. dCAPS-праймеры разработаны на основе последовательностей генов FAD3 А- и С-геномов Brassica napus L., представленных в базе данных GenBank (EF488043.1, EF488044.1). Состав смеси ПЦР аналогичен составу смеси ПЦР для детекции генов FAD2 и FAD3C. В качестве матрицы на первом этапе амплификации использовали 10 мкл тотальной ДНК (100 нг), на втором этапе амплификации — 2 мкл продукта ПЦР, полученного на первом этапе. Режим первого этапа амплификации: 94°C 4 мин; 35 циклов — 94°C 30 с, 59°C 1 мин, 72°C 1 мин; заключительная элонгация — 72°C 5 мин; второго этапа амплификации: 94°C 4 мин; 35 циклов — 94°C 30 с, 56°C 1 мин, 72°C 30 с; заключительная элонгация — 72°C 5 мин. Далее проводили гидролиз продуктов амплифи-
кации с помощью эндонуклеазы рестрикции Bst-nI. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 3%-ном агарозном геле с добавлением эти-диум бромида с нанесением в лунки 10 мкл ПЦР-продукта и 2 мкл загрузочного буфера (ОДО "Праймтех", Беларусь). Электрофорез проводили в течение 2 ч при напряжении 100 В. В ходе реакции эндонуклеаза рестрикции BstnI гидролизует фрагмент ДНК А-генома, несущий аллель дикого типа FAD3A гена с образованием фрагментов гидролиза 311 и 28 пн, мутантный аллель (339 пн) не гидролизуется. В С-геноме последовательность аллеля дикого типа гидролизуется с образованием фрагментов рестрикции 174 и 36 пн, мутантный аллель (210 пн) не гидролизуется.
Частоту мутантного аллеля рассчитывали как отношение числа индивидуальных растений одной формы, у которых детектировался мутантный аллель, к общему числу проанализированных растений данной формы.
Анализ аллелей генов FAD3A и FAD3C выполнен также методом SNaPshot согласно Mikolaic-zyk et al. [12]. Для снижения стоимости анализа исходные праймеры модифицированы за счет удлинения поли(А)-структуры до 34 пн для mutA-lf и до 46 пн для mutC-45F, а также использован ДНК-маркер длины высокой плотности для фрагментного анализа S450 (НПО "Синтол", РФ) [14]. Размер детектируемых фрагментов: FAD3A (fad3a) — 62 пн, FAD3C (fad3c) — 66 пн. Электрофорез SnaPshot продуктов проводили на генетическом анализаторе ABI Prism3500 (Applied Biosystems, США).
Жирнокислотный состав масел определяли методом газожидкостной хроматографии согласно ГОСТ Р 51483-99 [15]. Условия хроматографи-рования: газовый хроматограф модели 3700 (ПКГ "Гранат", РФ), колонка стеклянная длиной 2 м, внутренний диаметр 3 мм; твердый носитель —
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.