ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 407-413
УДК 577.112.853.088
ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКА-ИНАКТИВАТОРА АДГЕЗИВНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2004 г. В. П. Ямскова*, Е. Ю. Рыбакова*, А. А. Виноградов**, В. В. Вечеркин**,
И. А. Ямсков**
*Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 117808 Москва **Институт элементоорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН; Москва 117813
Поступила в редакцию 19.05.2003 г.
Из сыворотки крови крупного рогатого скота был выделен и очищен до гомогенного состояния белок с молекулярной массой 70 кДа, обратимо инактивирующий адгезивный сывороточный глико-протеин (СГП) с молекулярной массой 12 кДа, который проявлял биологическую активность в сверхмалых дозах. Данные анализа аминокислотного состава белка-инактиватора позволили отнести его к группе преальбуминов сыворотки крови позвоночных. Вторичная структура молекулы белка-инактиватора характеризовалась высоким содержанием а-спиралей. Изучены условия инактивации СГП. Показано, что взаимодействие белка-инактиватора с СГП протекало длительно, в течение 1 сут, причем обязательным условием инактивации СГП являлось присутствие ионов кальция. На основании полученных данных высказано предположение о том, что инактивация СГП происходит в результате образования молекулярного комплекса между инактиватором и СГП, в основе которого лежит углевод-белковое взаимодействие.
Поиск и исследование эндогенных биорегуляторов у млекопитающих и человека являются актуальными задачами современной биохимии. Среди таких биологически активных молекул, как гормоны, цитокины и нейтрофины, адгезивные белки занимают особое место, поскольку их специфическая биологическая активность обеспечивает протекание морфогенетических реакций клеток, которые в свою очередь обусловливают установление и поддержание межклеточных взаимодействий в тканях [1-3]. Одним из таких белков, участвующих в адгезионном процессе клеток, является ранее обнаруженный нами в крови позвоночных сывороточный гликопротеин (СГП) с молекулярной массой около 12 кДа [4, 5]. В сверхмалых дозах, соответствующих 10-14-10-19 М, СГП оказывает влияние на свойства плазматической мембраны клеток, внутриклеточные синтетические процессы, стимулирует клеточную адгезию и пролиферацию in vitro [4, 6-8]. Кроме того, было установлено, что СГП в сверхмалых дозах стимулирует процессы восстановления и репарации в тканях после механической травмы [9].
Ранее было показано, что СГП присутствует в сыворотке крови взрослых особей и эмбрионов млекопитающих в различном состоянии: во всем постнатальном периоде СГП находится в неактивном состоянии, вероятно, из-за образования комплекса с другим сывороточным белком-инак-тиватором, а в первые две трети эмбрионального развития СГП присутствует в сыворотке крови в активном состоянии [10]. Было показано, что инактивация СГП в последней трети эмбриогене-
за происходит постепенно: в течение этого периода наблюдалось снижение активности СГП до полной его инактивации к моменту рождения особи [4, 10]. Белок-инактиватор не был нами идентифицирован, его присутствие в сыворотке крови млекопитающих только предполагалось и нуждалось в экспериментальном подтверждении. Кроме того, вопрос о состоянии в сыворотке крови позвоночных такого биологически активного вещества, как СГП, требовал проведения отдельного исследования, поскольку обратимая инактивация гликопротеина в сыворотке крови как результат связывания с другим сывороточным белком представлялся эффективным способом его депонирования и регуляции биологической активности в организме.
Цель исследования - разработка метода выделения и очистки из сыворотки крови крупного рогатого скота белка-инактиватора, изучение его физико-химических свойств, состава и структуры молекулы, а также молекулярного механизма инактивации СГП белком-инактиватором.
МЕТОДИКА
В работе использовали препарат сыворотки крови крупного рогатого скота (15 л), стерильный, инактивированный коммерческий препарат, который применяется в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур, производства завода биопрепаратов Московского мясокомбината.
408
ЯМСКОВА и др.
Исследование биологической активности СГП проводили на мышах-гибридах линий С57ВЬ и СВА (самцы весом 18-20 г). СГП выделяли из сыворотки крупного рогатого скота по разработанной ранее методике, включающей высаливание сывороточных белков в насыщенном растворе (КН4)28 04 и изоэлектрофокусирование [4, 5].
Аффинную хроматографию СГП проводили на колонке, в которой в качестве сорбента использовали сефарозу 4В с иммобилизованным конканавалином А. Полученную после изоэлект-рофокусирования фракцию СГП с рН 4.7-5.1 [4], диализовали против физиологического раствора содержащего 1 мМ СаС12, 0.1 мМ МпС12, 0.1 мМ азида натрия и разделяли методом аффинной хроматографии. 10 мл фракции наносили рециркуля-ционно на колонку с иммобилизованным конканавалином А на сефарозе 4В при 4°С в течение 100 ч со скоростью 1-2 мл/мин. Сорбент промывали физиологическим раствором в течение 36 ч, а затем элюировали СГП путем рециркуляционной подачи физиологического раствора, содержащего 10 мМ СаС12, 0.1 мМ МпС12, 1 М метил-а-Б-маннозида и 0.1 мМ азида натрия в течение 100 ч. Полученную таким образом фракцию собирали, диализовали против физиологического раствора, содержащего 10 мМ СаС12, и использовали для определения биологической активности.
Для выделения белка-инактиватора осадок сывороточных белков, полученный после центрифугирования (25000 20 мин), высаленной (КН4)2Б04 сыворотки крови, растворяли в дистиллированной воде, объем которой равен 1/3 объема сыворотки крови перед высаливанием. К полученному раствору добавляли сухой (КН4)2Б04 до 70%-ного насыщения, образовавшийся осадок удаляли центрифугированием (25 000 20 мин). К полученному супернатанту добавляли еще (КН4)2Б04 до 90%-ного насыщения и оставляли смесь на 90 ч при охлаждении. Флотирующую фракцию, в которой присутствовал белок-инактиватор, собирали после центрифугирования (105000 30 мин), растворяли в бидистилляте, проводили длительно диализ против бидистиллята до полного удаления ионов аммония, а затем против физиологического раствора следующего состава: 1 мМ СаС12, 0.1 мМ МпС12 и 0.1 мМ азида натрия. Белки, содержащиеся в полученном растворе, далее разделяли с помощью метода аффинной хроматографии. 20 мл белкового раствора наносили при 4°С рециркуля-ционно на колонку с сорбентом, представляющим собой сефарозу 4В с иммобилизованной манно-зой, в течение 100 ч со скоростью 1-2 мл/мин. Далее сорбент промывали свежим физиологическим раствором в течение 36 ч и производили элюцию белка-инактиватора путем рециркуляционной подачи физиологического раствора следующего состава: 10 мМ СаС12, 0.1 мМ МпС12, 1 М метил-а-Б-ман-нозид и 0.1 мМ азид натрия в течение 100 ч.
Полученный раствор собирали, проводили диализ против физиологического раствора, содержащего 10 мМ СаС12 и далее исследовали его биологическую активность.
Изоэлекрофокусирование белка-инактиватора проводили на колонке LKB-110 ("LKB", Швеция) в градиенте концентрации сахарозы и рН, используя и амфолиты ("Serva", Швеция) в диапазоне рН 2.510.0, при 4°C и напряжении 500-1500 В, в течение 48 ч. 250 мкг исследуемого препарата вводили в тяжелый градиентный раствор. Определение содержания фракций проводили с помощью спектрофотометра при 280 нм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 230, 235, 260, 280 нм [11].
Исследование белка-инактиватора методом об-ращеннофазовой ВЭЖХ осуществляли на хроматографе "Yanaco" (Япония), на колонке Altex RPSC (4.6 х 75 мм), используя для элюции градиент концентрации ацетонитрила (с 0.1%-ной трифторук-сусной кислотой) от 20 до 80% в течение 20 мин при скорости 1 мл/мин.
Определение аминокислотного состава проводили на анализаторе Hitachi 835 (Япония), как указано в работе [5].
Электрофорез в ПААГ проводили на приборе для вертикального электрофореза АВГЭ-1 (СССР), как указано в [5]. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор белков фирмы "LKB" (кДа): фосфорилаза b (94), БСА (67), овальбумин (45), карбоангидраза (30), соевый ингибитор трипсина (20), лизоцим куриный (14.4).
Исследование инактивации СГП проводили следующим образом. Готовили два раствора, используя питательную среду DMEM ("Sigma" США). Раствор 1 содержал 1 мл 10-6 М белка-инактиватора; раствор 2-1 мл 10-10 М СГП. Было проведено несколько серий определений при 37 и 4°C.
Для осуществления инактивации СГП в опытные флаконы к 1 мл среды DMEM добавляли 200 мкл раствора 1 и 50 мкл раствора 2. В качестве первого контроля использовали раствор СГП. Для этого к 1.2 мл среды DMEM добавляли 50 мкл раствора 2, а второй контроль содержал 1.25 мл среды DMEM.
В обеих экспериментальных сериях полученные таким образом растворы инкубировали в течение 18 ч: в первой серии - при 37°C; а во второй - при 4°С. Далее эти белковые растворы использовали в качестве питательной среды для культивирования органной культуры печени и определяли биологическую активность с помощью адгезиомет-рического метода [4].
Исследование биологической активности СГП при контакте с БСА проводили в аналогичных условиях при 4°С.
D
280
(а)
0 1.6 1.2
0.8 0.4
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
pH 14 12 10 8 6 4 2 0
(б)
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 № фракций
14 12 10 8 6 4 2 0
Рис. 1. Изоэлектрофокусирование в градиенте концентрации сахарозы и рН от 3.5 до 10.0 сыворотки (а) и супернатанта, выделенного из сыворотки крови крупного рогатого скота (б). 1 - рН; 2 - D280.
Определение биологической активности белковых фракций сыворотки крови, а также раствора СГП в присутствии белка-инактиватора или БСА проводили с помощью метода оценки параметра, характеризующего вязкоупругие свойства ткани при стандартном деформационном воздействии [4]. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
Спектры кругового дихроизма (КД) снимали на дихрографе Jasco 720 (Япония), оснащенном системой компьютерной обработки данных, как указано в [5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.