ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2013, том 47, № 5, с. 400-402
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ ФОТОБИОЛОГИЯ
УДК 535.37, 544.77
ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВЫХ ПОКРЫТИЙ НА МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ МЕТОДОМ СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
© 2013 г. П. Г. Пронкин, А. В. Бычкова, О. Н. Сорокина, А. Л. Коварский, М. А. Розенфельд, А. С. Татиколов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: pronkinp@gmail.com Поступила в редакцию 11.01.2013 г. В окончательном виде 03.04.2013 г
Б01: 10.7868/80023119713050116
Создание биосовместимых покрытий на поверхности магнитных наночастиц (МНЧ) открывает перспективы их использования в медицине [1, 2]. Особый интерес представляет создание устойчивых покрытий на основе белков. Новый свободнорадикальный способ создания устойчивых белковых покрытий на поверхности индивидуальных МНЧ, основанный на свойстве белков подвергаться модификации с образованием межцепочечных ковалентных связей под действием свободных радикалов, генерируемых на поверхности МНЧ по реакции Фентона [3], позволяет преодолеть проблемы, традиционно возникающие при создании белковых покрытий на поверхности МНЧ: образование полидисперсного ансамбля частиц, неизбирательное сшивание белков, приводящее к сшиванию макромолекул в растворе, десорбция покрытий [4, 5]. В [6] свободноради-кальный способ реализован на примере сывороточного альбумина. Полученные покрытия формировались на индивидуальных наночастицах и характеризовались высокой устойчивостью. В настоящее время развиты различные подходы к исследованию процессов адсорбции белков на на-нообъектах и функциональных свойств белков с использованием ИК-спектроскопии, УФ-спек-трофотометрии, ЭПР-спектроскопии спиновых меток и др. [6, 7]. Эти подходы имеют ограничения при исследовании функциональных свойств белка, адсорбированного на МНЧ. Цель данного сообщения — разработка спектрально-флуоресцентного метода для исследования процессов адсорбции белков и их функциональных свойств в составе сшитых по свободнорадикальному механизму покрытий на МНЧ.
МНЧ магнетита синтезировали соосаждением солей двух- и трехвалентного железа в щелочной среде и стабилизированы фосфатцитратным бу-
фером с pH 4 по методике [6]. Средний размер МНЧ, который оценивался методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano-S ("Malvern", Англия), составлял ~15 нм.
Для получения сшитых по свободнорадикаль-ному механизму покрытий из сывороточного альбумина человека (САЧ) на МНЧ магнетита использовали 2.8 мл раствора САЧ ("Sigma-Ald-rich", США) в 0.05 М фосфатном буфере pH 6.5 с концентрацией 3 мг/мл, 50 мкл 3%-го раствора пе-роксида водорода и 0.35 мл гидрозоля магнетита с концентрацией МНЧ 15 мг/мл (образец А-НЧ-1). Использовали также образцы: А-НЧ-0, отличающийся от А-НЧ-1 отсутствием пероксида водорода; н-А-НЧ-1 и н-А-НЧ-0 — надосадочные растворы, отобранные из А-НЧ-1 и А-НЧ-0 соответственно в процессе магнитной сепарации. Раствор САЧ с концентрацией 2.6 мг/мл и раствор МНЧ с концентрацией 1.6 мг/мл использовали в качестве контролей — К-А и К-НЧ соответственно.
Для исследования систем, содержащих МНЧ и САЧ, использовали краситель-зонд 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиакар-боцианинбетаин (ТКБ). В водном растворе ТКБ находится главным образом в виде цис-димера (^abs = 535 нм, практически не флуоресцирует) и может образовывать устойчивые J-агрегаты (характерны узкие пики с ^abs = 645 нм и = 660 нм). В присутствии САЧ образуется нековалентный комплекс транс-мономера (^abs = 612 нм) [8]. Большой спектральный сдвиг, высокая константа связывания (>106 л моль-1), высокий квантовый выход флуоресценции связанного с белком красителя (0.57) делают ТКБ эффективным спектрально-флуоресцентным зондом на САЧ [8]. При флуо-риметрическом титровании в буферный раствор
ИCCЛЕДОВAНИЕ БЕЛKОВЫХ ПОKРЫТИЙ НA MAГНИТНЫХ НAНОЧACТИЦAХ
401
(рН 6.5), содержащий краситель (сТКБ ~ (2—5) х х 10-6 моль л-1), добавляли равные объемы растворов-образцов. Оценка взаимодействия САЧ с ТКБ в образцах осуществлялась в терминах эффективной концентрации белка (сей), равной отношению интенсивностей флуоресценции комплекса ТКБ-САЧ в образцах и в растворе К-А (безразмерная величина).
Спектры поглощения красителей измеряли на спектрофотометре "СФ-2000" (Россия), флуоресцентные измерения — на спектрофлуориметре "Флюорат-02-Панорама" (Россия) в стандартных (1 см) кварцевых кюветах. Спектры флуоресценции корректировали на спектральную характеристику канала возбуждения прибора и на сигнал пропускания образца. Для учета эффекта внутреннего фильтра (поглощение флуоресценции ТКБ наночастицами) выполнялась дополнительная коррекция спектров. Для этого использовался поправочный множитель, учитывающий падение сигнала флуоресценции полосы J-агрегатов ТКБ при росте концентрации МНЧ в кювете, поскольку в условиях эксперимента (низкая концентрация САЧ) введение белка в растворы ТКБ не влияло на интенсивность флуоресценции полосы J-агрегатов (спектры К-А).
Результаты флуориметрического титрования приведены на рисунке. Добавление растворов А-НЧ-0, А-НЧ-1, н-А-НЧ-0 и н-А-НЧ-1 в кювету с ТКБ приводит к росту интенсивности флуоресценции (1—4, комплекс транс-мономера). В случае К-НЧ флуоресценция не увеличивалась (данные не приведены). Значения се(Г в образцах А-НЧ-0 и А-НЧ-1 оказались близкими (69 ± 3% и 68 ± 3% соответственно). Уменьшение се(Г по сравнению с К-А может объясняться эффектом стери-ческого экранирования центров связывания САЧ наночастицами в результате адсорбции белка на их поверхности. По-видимому, гидрофобная область молекул альбумина (с которой связывается ТКБ) в результате адсорбции становится недоступной растворителю и вследствие этого невозможно присоединение к такому белку флуоресцентного зонда. В случае образца н-А-НЧ-0 се(Г= = 93 ± 5%, что может быть обусловлено практически полным высвобождением нековалентно связанных макромолекул альбумина с поверхности МНЧ в процессе магнитной сепарации и сохранением способности этих молекул связываться с зондом. Это указывает, по-видимому, на восстановление исходной нативной конформации молекул САЧ при десорбции. В н-А-НЧ-1 се(Г белка оказалась низкой по сравнению с се(Г в А-НЧ-0 и А-НЧ-1 — 42 ± 3%. Вероятно, этот результат объясняется тем, что в составе закрепленного по сво-боднорадикальному механизму покрытия на МНЧ содержатся молекулы белка, доступные для связывания с ТКБ, которые в результате магнит-
4 (отн. ед.) 35
30
25
20
15 -
10 -
5
0
0
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
Зависимости интенсивности флуоресценции ТКБ (СТКБ = 4 х 10—6 моль л-1) от общего содержания САЧ в образцах А-НЧ-0 (1), А-НЧ-1 (2), н-А-НЧ-0 (3), н-А-НЧ-1 (4) и в К-А (5).
ной сепарации оказались в осадке. Совпадение значений се(Г в образцах А-НЧ-0 и А-НЧ-1 при их различающихся размерах (~25 и ~20 нм соответственно) подтверждает этот вывод.
Таким образом, использование флуоресцентного красителя ТКБ при исследовании систем, содержащих МНЧ и человеческий сывороточный альбумин, позволяет анализировать процессы сорбции белка и доступность его гидрофобного кармана растворителю. Показано, что в противоположность белку в составе незакрепленного адсорбционного слоя некоторая часть макромолекул, входящих в состав альбуминового покрытия на МНЧ, сшитого по свободнорадикальному механизму, сохраняет способность к связыванию с флуоресцентным красителем, что позволяет в первом приближении сделать вывод о сохранении натив-ных функциональных свойств этого белка.
Авторы благодарят Б.И. Шапиро (ГОСНИИ-ХИМФОТОПРОЕКТ) за любезно предоставленный краситель.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 12-03-31452 и 13-03-00863).
CTHœK ЛИТЕРAТУРЫ
1. Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Розенфельд М.А., Ко-варский A.Л. II Успехи химии. 2012. Т. 81. № 11. С. 1026.
2. Reddy L.H., Arias J.L., Nicolas J., Couvreur P. || Chem. Rev. 2012. V. 112. № 11. Р. 5818
3. Розенфельд М.А., Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Ковар-ский А.Л., Леонова В.Б., Ломакин С.М., Макаров Г.Г.
XMMM EbiœKMX ЭНЕРГИЙ том 47 № 5 2013
402
ПРОНКИН и др.
Способ получения белковых покрытий на поверхностях твердых тел, содержащих ионы металлов переменной валентности. Заявка на получение патента РФ № 2011136972, приоритет от 08.09.2011.
4. Peng Z.G., Hidajat K., Uddin M.S. // J. Colloid Interface Sci. 2004. V. 271. P. 277.
5. Li F.Q., Su H., Wang J., Liu J.Y, Zhu Q.G., Fei Y.B, Pan Y.H., Hu J.H. // Int. J. Pharm. 2008. V. 349. P. 274.
6. Бычкова А.В., Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Сорокина О.Н., Ломакин С.М., Коварский А.Л. // Коллоид. журн. 2013. Т. 75. № 1. С.9.
7. Переведенцева Е.В., Су Ф.И., Су Т.Х., Лин И.Ч., Ченг Ч.Л., Карменян А.В., Приезжев А.В., Лугов-цов А.Е. // Квантовая электрон. 2010. Т. 40. № 12. С.1089
8. Tatikolov A.S., Costa S.M.B. // Biophys. Chem. 2004. V. 107. P. 33.
ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ том 47 № 5 2013
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.