m
БИО ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 1 * 1993
УДК 577.113.(4 + 7)
© 1993 Е. В. Вязовкина, Н. И. Комарова, А. В. Лебедев
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИАСТЕРЕОМЕРОВ НЕИОННЫХ АНАЛОГОВ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ VII *. СИНТЕЗ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДИАСТЕРЕОМЕРНЫХ ДЕЗОКСИДИНУКЛЕОЗИДМЕТИЛФОСФОНАТОВ
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск
Синтезированы и разделены хроматографией все 16 пар диастереомеров дезоксидинуклеозидме-тилфосфонатов, энантиомерных по межнуклеозидному метилфосфонату. Установлено, что диастере-омер, элюируемый первым при хроматографии на силикагсле, имеет большую подвижность и при хроматографии на обращенной фазе. Записаны УФ-спектры и спектры КД всех пар диастереомеров. Показано, что для элюируемого первым диастереомера по сравнению с менее подвижным вторым наблюдается более высокий уровень как гипохромного эффекта, так и эффекта Коттона в КД-спектре. Сделано предположение, что независимо от состава дезоксидинуклеозидметилфосфонатов все первые диастереомеры (так же как и все вторые) имеют одну и ту же абсолютную конфигурацию меж-нуклеотидного метилфосфонатного фрагмента.
Олигонуклеозидметилфосфонаты — нсионные аналоги олигонуклеотидов, содержащие 5'-3'-метилфосфонатную связь, обладают особыми физико-химическими и биологическими свойствами [2, 3]: они способны образовывать стабильные комплементарные комплексы с ДНК и РНК; кроме того, они устойчивы по отношению к клеточным нуклеазам и способны эффективно проникать в клетку. В литературе описан ряд методов синтеза таких олигонуклеотидных аналогов:
1) синтез с применением конденсирующих реагентов, таких, как дицикло-гексилкарбодиимид, арилсульфонилхлориды или арилсульфонилтетразолиды [2, 4-6];
2) синтез с применением метилдихлорфосфина как бифункционного фосфи нилирующего и конденсирующего реагента [7, 8 ];
3) синтез с использованием комбинации метилфосфонодихлорида с арилсуль-фонилтетразолидом, как фосфонилирующего и конденсирующего реагентов соответственно [9—11].
Каждый асимметрический атом фосфора в синтезированных олигонуклео-зидметилфосфонатах обусловливает возможность появления пары диастереомеров (необходимо учитывать наличие асимметрических атомов углерода в остатках нуклеозидов), что приводит к образованию 2п изомеров (п — число метилфосфонатных фрагментов). Физико-химические и биологические свойства индивидуальных диастереомеров могут значительно различаться. Целью настоящей работы был синтез всех 16 пар динуклеозидметилфосфонатов, разделение их на индивидуальные диастереомеры и получение их физико-хими-
* Сообщение VI см. [1]. Использованы стандартные сокращения: ib — изобутирил, Nue — нуклеозид; кроме того, DMT и ММТ — диметокси- и монометокситритил, Tetr — тетразол.
ческих характеристик с целью дальнейшего определения абсолютных конфигураций.
Для синтеза дидезоксинуклеозидметилфосфонатов в растворе нами был адаптирован метод, разработанный Миллером [11] для синтеза метилфосфо-натных производных олигонуклеотидов на полимерном носителе. В отличие от работы [11] фосфонилирующий реагент — метилфосфонобисимидазолид (III), образующийся при смешении метилфосфонодихлорида (I) с 5-кратным избытком имидазола (II), получали в абсолютном ацетонитриле, а осадок имидазолийхлорида отделяли перед добавлением З'-ОИ-нуклеозидного компонента (см. схему):
О
(Л) У N _ >—-
CHSP(0)C12 ---—cHj-p-nTJ + сг н-<©1
/т) 1 4 V
(1) Ш) n н
Lft ^ажшнисш ч
о ч о
, « Tetr Ч II /=N (BMT)dNucO-P-H^J ------ (BMTjdNucO-P-O (I)
I n-м у
CH* / СНч
(Ш) Г3 / Г3
„ ,„ . I / (BMT)dNuc'
Nuc(Ac) Н,0/ ' |
/ Ш) |
(Ш) I /
О /О о
К / II I II
(BMT)riNucO —Р—GdNuc(flc) (BMT)dNuc0-P-0~ (DMT)dNucO-P-OdNuc(BMT)
(Ю снз Ш снз (И) СН3
К полученному раствору метилфосфонобисимидазолида (III) добавляли расчетное количество З'-ОН-нуклеозидного компонента (IV), растворенного в абсолютном пиридине (см. схему). В результате реакции образовывался соответствующий 5'-диметокситритилнуклеозид-3'-метилфосфоноимидазолид (V) и побочный продукт (З'-З')-метилфосфонодинуклеозид (VI). Последний получается при реакции 5'-диметокситритилнуклеозида (IV) с образовавшимся 5'-диметокситритилнукле-озид-З'-метилфосфоноимидазолидом (V). Для ускорения следующей стадии в реакционную смесь добавляли гетразол (Tetr). Образовавшийся 5'-диметокси-тритилнуклеозид~3-метилфосфонотетразолид (VII) реагирует далее с 5'-ОН-нук-леозидным компонентом (VIII), давая динуклеозидметилфосфонат (IX). Несмотря на образование побочного продукта (VI) и некоторое количество продуктов гидролиза (X), выход димера (IX) после хроматографии составлял 60—83 %. Это позволяет считать такой метод синтеза приемлемым для получения коротких олигонуклеозидметилфосфонатов, таких, как димеры. В дальнейшем эта методика была использована для синтеза метилфосфонатных производных олигонуклеотидов от 2 до 7 звеньев (результаты будут опубликованы отдельно).
Для всех димеров удалось подобрать оптимальные условия разделения двух образовавшихся диастереомеров на колонке с силикагелем. В необходимых случаях для более полного разделения диастереомеров проводили рехроматографию полученных фракций. В табл. 1 представлены условия разделения для всех пар диастереомеров. Две пары диастереомеров, (DMT)ibdGp(CH3)bzdA(Ac) и (DMT)dTp(CH3)ibdG(Ac), удалось разделить в препаративном масштабе только после удаления 5'-диметокситритильной группы. Полученные индивидуальные диастереомеры обозначены номерами 1 и 2, в соответствии с порядком их выхода с колонки. Как видно из данных табл. 1, степень чистоты полученных диасте-
Хроматографические характеристики дезоксидинуклеозидметилфосфонатов
Соединение Выход Суммы диастерео-меров, % Условия разделения * Аналитическая хроматография * мин *
содержание метанола, % Я), мин
(ОМТ)!ЬсЮр(СНз)1Ьс]С(Ас) 1 0 5,91 15,65
72 А 5
2 1 8,23 16,18
ШМТ) ibdGp (СНз) Ьг<1 А (Ас) .1 0 4,27 15,44
63 А4' 5
2 5 4,00 16,64
фМТ)МСр(СНз)аТ<Ас) 1 0 7,95 16,06
71 А 3
2 5 13,68 17,23
ШМТНЬсЮр(СНзМС(Ас) 1 1 4,56 16,66
70 В 3
2 5 4,93 17,58
(ОМТ) bzdAp (СНз) ¡ЬсЮ (Ас) 1 0 3,55 15,54
83 В 5
2 6 3,83 16,27
ДОМТ) ЬгйАр (СНз) ЬгаЛ (Ас) 1 0 3,69 16,74
74 А 5
2 0 4,58 17,86
(ОМТ) Ьгс1Лр (СНз) (1Т (Ас) 1 0 2,56 17,06
66 А 5
2 4 3,05 18,03
ШМТ) bzd Ар (СНз) Ьгс1С (Ас) 1 0 3,02 16,05
61 А 3
2 5 3,37 16,70
(ОМТЫТр(СНз)^С(Ас) 1 0 8,39 14,40
60 А4* 3
2 3 8,63 14,99
(ММТ) dTp (СНз) bzdA (Ас) 1 0 2,69 15,89
66 А 5
2 3 2,89 16,63
(ММШТр(СНзЫТ(Ас) 1 0 3,93 16,26
65 А 3
2 2 4,96 16,98
(ММТ) dTp (СНз) bгdC (Ас) 1 0 2,08 15,19
62 В 5
2 0 2,10 15,67
(ОМТ) bzdCp (СНз) ibdG (Ас) 1 0 3,42 12,69
68 В 5
2 5 3,42 13,43
ШМТ) bzdCp (СНз) ЬгйА(Ас) 1 0 5,55 14,63
64 А 3
2 3 6,90 15,22
(ОМТ)Ь«1Ср(СНз)аТ(Ас) 1 0 2,08 15,75
71 А 5
2 5 2,36 16,58
(ОМТ) ЬгаСр (СНз) bzdC (Ас) 1 0 2,87 13,31
60 А 3
2 6 3,31 13,64
реомеров составляет от 94 до 100%. Для получения более полной характеристики в табл. 1 приведены времена удерживания диастереомеров при изократической хроматографии на силикагеле. Во всех случаях для 5'-ди- или 5'-монометоксит-ритильных производных динуклеозидметилфосфонатов порядок выхода диастереомеров не изменялся по сравнению с препаративной хроматографией на силикагеле в градиенте концентрации метанола.
После удаления всех защитных групп и выделения продуктов (см. «Экспериментальную часть») был проведен анализ фракций индивидуальных диастереомеров методом обращенно-фазовой хроматографии (табл. 1). По результатам препаративного разделения и анализа в выбранных нами хроматографических системах видно, что диастереомер, обозначенный номером 1, элюируется первым независимо от выбора растворителей, типа хроматографии, сорбента, наличия 5'-защитной группы (подобные результаты получены в работах 2, 12). Исключение составляет только димер сЮр(СН3)<ЗА, для которого наличие или отсутствие 5 '-диметокситритильной группы меняет порядок выхода диастереомеров при разделении на силикагеле. Таким образом, в подавляющем большинстве случаев различие в сродстве к сорбентам определяется тем, в какой из двух конфигураций (Яр или 5р) находится асимметрический фосфор метилфосфонатного фрагмента димера.
Для природных динуклеозидмонофосфатов в водных растворах характерно наличие стэкинг-взаимодействия гетероциклических оснований, которое обычно регистрируется по эффекту гипохромии и спектрам кругового дихроизма. Для диастереомеров дезоксидинуклеозидметилфосфонатов с!Ар(СН3)с1А ранее было показано, что величина эффекта гипохромии составляет 11 и 7% для первого и второго диастереомеров соответственно [2]. Величина эффекта гипохромии составляет от 1,5 до 16% для различных димеров, а конкретно для <1Ар(СН3)с1А 13 и 4,5% (табл. 2), что практически совпадает с опубликованными результатами. Очевидно, что конфигурация метилфосфонатного фрагмента должна влиять на пространственное строение диастереомера, а следовательно, определять степень стэкинг-взаимодействия плоскостей оснований. Можно было ожидать, что лишь одна из конфигураций более благоприятна для стэкинг-взаимодействия. Из данных табл. 2 видно, что во всех случаях первый диастереомер показывает более высокую степень гипохромии, а следовательно, больший стэкинг гетероциклических оснований. (Хотя точность, с которой в работе определены величины эффектов гипохромии, недостаточно высока для количественных сопоставлений, полученные данные позволяют делать надежные качественные выводы.) Отметим, что в случае пуриновых димеров процент гипохромии выше, чем в случае пиримидиновых. Это согласуется с данными по стэкингу для природных дезок-сидинуклеозидмонофосфатов [13].
Известно, что форма и амплитуда спектров КД динуклеозидмонофосфатов и их производных зависят не только от степени перекрывания плоскостей оснований, но и от их взаимного расположения в пространстве, т. е. наклона плоскостей
* Условия препаративного разделения на силикагеле см. «Экспер. часть»: А — градиент метанол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.