МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 461-464
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.31:581.557+633.358
ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ АГГЛЮТИНИНОВ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICIAE 252 ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИХ С УГЛЕВОДНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ КОРНЕЙ ГОРОХА
© 2004 г. Л. В. Карпунина*, М. С. Смиян*, Л. В. Косенко**
*Саратовский государственный аграрный университет им. НИ. Вавилова **Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 12.08.03 г.
Показано, что взаимодействие агглютинирующих белков-ферментов, локализованных на поверхности Rhizobium leguminosarum bv. viciae 252, с углеводными компонентами корней растения-хозяина (гороха) приводит к изменению их ß-глюкозидазной и протеолитической активности.
Ключевые слова: Rhizobium, агглютинины, ферменты, корни гороха.
В настоящее время вопросы, связанные с выявлением возможных рецепторов для лектинов бактерий на самых начальных этапах прикрепления бактерий к растительной клетке и изучением роли бактериальных лектинов при таком взаимодействии, остаются еще малоизученными. Имеются немногочисленные публикации о том, что растительными рецепторами для лектинов почвенных азотфиксирующих бацилл являются белки и углеводные компоненты корней пшеницы [1, 2]. В отношении симбиотических бактерий известно, что рецепторами агглютининов ризобий являются белковые компоненты корней гороха [3], относительно растительных углеводных составляющих данных в литературе не имеется. Практически отсутствуют сведения о бактериальных лектинах, обладающих ферментативной активностью, и ее изменении при взаимодействии бактерий с растениями в процессе образования различного рода азотфиксирующих ассоциаций.
В связи с этим целью наших исследований явилось изучение взаимодействия агглютининов Я. leguminosarum Ъу. ушав 252 с углеводными компонентами корней гороха и исследование их ферментативной активности (в-глюкозидазной и протеолитической) при таком взаимодействии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследований служил штамм ЯЫ10-Ьшт leguminosarum Ъу. viciae 252, полученный из Всероссийской коллекции Rhizobium ВНИИСХМ (Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург, Пушкин) и его мутант - штамм Я. leguminosarum 252/7, дефектный по гемагглю-
тинирующей активности (ИБФРМ РАН). Оба штамма R. leguminosarum bv. viciae выращивали в течение трех суток при 28°C на жидкой синтетической среде [4].
Агглютинины и неагглютинирующие белки выделяли с бактериальной поверхности по методу, описанному ранее [3].
Мутантный штамм 252/7, дефектный по гемаг-глютинирующей активности, был получен с помощью нитрозогуанидина [5].
Из штамма 252 получали экзополисахарид (ЭПС) и липополисахарид (ЛПС), как описано Косенко с соавт. [6].
Для выделения фракции экзокомпонентов (Фэ) использовали четырехсуточные корни проростков гороха сорта Уладовский юбилейный. Семена гороха проращивали в асептических условиях на чашках Петри со стерильной дистиллированной водой. Углеводную часть фракции экзокомпонентов получали после осаждения из нее белков 40%-ной трихло-руксусной кислотой. Содержание углеводов определяли по реакции с фенолом и серной кислотой [7].
Инкубацию агглютининов ризобий (20 мкг/мл) с углеводной частью Фэ и с ЭПС и ЛПС (1%) в соотношении 1 : 1 проводили в течение 30 мин при 28°C.
Гемагглютинирующую активность белков определяли реакцией агглютинации с самопроизвольным осаждением эритроцитов, используя для этой цели 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритоцитов.
Р-глюкозидазную активность определяли по методу Kwon с соавт. [8]. За единицу активности фермента принимали количество ммоль продукта (p-ни-трофенола), образующегося за 1 мин на мг белка.
Протеолитическую активность определяли по методу Preston с соавт. [9]. Активность фермента
Таблица 1. Активность гидролитичесих ферментов у агглютининов R. leguminosarum bv. viciae 252 и его мутанта 252/7
Ферменты R. leguminosarum 252 M ± m R. leguminosarum 252/7 M ± m p
Протеолитические, R, 0.038 ± 0.004 R'i 0.038 ± 0.008 <0.1
мкг/(мин мкг белка) R? 0.062 ± 0.008 R2 0.023 ± 0.0001 <0.001
ß-глюкозидаза, R, 0.150 ± 0.0005 R'i 0.280 ± 0.002 <0.01
ммоль/(мин мг белка) R2 0.050 ± 0.003 R2 0.220 ± 0.020 <0.01
выражали количеством мкг аланина, образованного в течение 1 мин на мкг белка.
Статистическую обработку проводили по методу Ойвина [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами было показано [3], что агглютинины как R1, так и R2 R. leguminosarum bv. viciae 252 располагаются равномерно по всей поверхности бактериальной клетки, не связаны с какими-либо фибриллярными структурами и являются по своей природе гликопротеинами. Агглютинины проявляли специфичность к сложным полисахаридам: экзополиса-хариду и липополисахариду своих собственных клеток [11]. К настоящему времени выделены лектины из различных групп микроорганизмов, однако лишь для немногих из них продемонстрировано присутствие одновременно гемагглютинирующей и ферме-тативной активности. К таким лектинам относятся бактериальные токсины некоторых энтеропато-генных бактерий [12-14]. Имеются данные о лекти-нах не токсинах, проявляющих ферментативные свойства, выделенных из Bacillus subtilis 316-M [15] и Bacillus polymyxa 1460 [16].
Агглютинины R. leguminosarum bv. viciae 252 (Rx и R2), выделенные с поверхности бактерий, наряду с гемагглютинирующей, обладали и ферментативной активностью: ß-глюкозидазной и протеолитичес-
кой. Белки мутантного штамма (R' и R2), у которых отсутствовала гемагглютинирующая активность, также проявляли ферментативную активность. Как видно из приведенных данных (табл. 1), ß-глюкозидазная активность у мутантного штамма 252/7 была выше, чем у родительского штамма: у
R 1 - в 1.9 раза, у R2 - в 4.4 раза, протеолитическая
активность R 1 была такой же как у Rb а у R2 была в 2.7 раза меньше, чем у агглютинина R2.
Выявленные нами различия ферментативной активности у белков мутантного штамма по сравнению с агглютининами родительского штамма позволили нам сделать предположение о взаимосвязи между гемагглютинирующей и ферментативной активностями. Встречающиеся в литературе сведения относительно ферментативных свойств бактериальных лектинов не позволяют достаточно четко
оценить их функциональную роль как для самой бактериальной клетки, так и при взаимодействии с растениями. В отношении лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий такие исследования практически отсутствуют. Имеется немного работ о взаимосвязи между ферментативной и гемагглютинирующей активностями. Так, ингибирование ге-магглютинации лектинов бацилл специфичными углеводами, как было показано нами ранее [16], приводило к изменению их протеолитической активности. Исходя из этих данных, интересно было знать, существует ли аналогичная зависимость между гемагглютинирующей и ферментативной активностями у других агглютинирующих белков-ферментов. С этой целью мы проводили исследования Р-глюкозидазной и протеолитической активности агглютининов ризобий после блокирования их гемагглютинирующей активности сложными бактериальными полисахаридами: ЭПС и ЛПС Я. legumi-nosarum ъу. viciae 252. Об отсутствии гемагглютинирующей активности агглютининов ризобий судили по реакции агглютинации с трипсинизированными кроличьими эритроцитами.
При определении Р-глюкозидазной активности после инкубации их с ЭПС и ЛПС ферментативная активность как у Я1, так и у Я2 изменялась (табл. 2). Для агглютинина Я1 после взаимодействия с ЭПС Р-глюкозидазная активность уменьшалась и составляла 0.12 ммоль/(мин мг белка) по сравнению с контролем; инкубирование Я2 с ЭПС приводило к увеличению ферментативной активности в 1.6 раза по сравнению с контролем. Инкубирование обоих агглютининов с ЛПС вызывало увеличение их Р-глюкозидазной активности. Так, при инкубации с ЛПС ферментативная активность составила 0.21 ммоль/(мин мг белка), а при взаимодействии Я2 с ЛПС - 0.11 ммоль/(мин мг белка), что в 1.4 и 2.2 раза соответственно превышало показатели контроля. Инкубирование агглютининов ризобий с полисахаридами повлияло и на их протеолитическую активность, которая была значительно меньше по сравнению с таковой у агглютининов родительского штамма. В результате взаимодействия с ЭПС протеолитическая активность уменьшалась по сравнению с контролем в 1.6 раза, с ЛПС - в 1.5 раза. Инкубирование Я2 с полисахаридами также сопровождалось уменьшением их протеолитической активности по сравнению с контролем: в 1.3 и 2.6 раза соответственно (табл. 2).
ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ АГГЛЮТИНИНОВ
463
Анализируя полученные результаты, можно предположить, что у агглютининов ризобий, также как и у лектинов бацилл [16], имеются два центра, один из которых отвечает за ферментативную, а другой - за гемагглютинируюшую активность. Очевидно, блокирование полисахаридными компонентами гемагглютинируюшего центра приводит к конформационным изменениям молекулы агглютинина, которые могут затрагивать центр, ответственный за ферментативную активность, что, в конечном счете, приводит к изменению сродства фермента к субстрату и, как следствие, вызывает либо увеличение, либо уменьшение ферментативной активности. Такое предположение - о наличии двух центров: ферментативного и лектинового на поверхности молекул а-галактозидазы и а-маннана-зы, было высказано и другими авторам [17, 18].
В сложных процессах образования бобово-ри-зобиального симбиоза агглютинины бактерий R. leguminosarum 252 [5], могут выполнять роль адгезинов. Как свидетельствуют литературные данные, специфические контакты между углеводными компонентами растений и рецепторами микроорганизмов могут осушествляться в муци-геле, покрываюшем поверхность корневых волосков и имеюшем в своем составе различные мо-носахаридные остатки [19, 20]. При взаимодействии ризобий с поверхностью корня растений, агглютинины ризобий, возможно, могут находить в муцигеле специфические углеводы, взаимодействие с которыми приводит к изменению их ферментативной активности. Для подтверждения этого предположения мы определяли ферментати
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.