МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 730-742
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.811.25
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ БАКТЕРИЙ
В СТРАТИФИЦИРОВАННЫХ ОСАДКАХ СОДОВЫХ ОЗЕР © 2014 г. Т. П. Турова*, **, М. А. Гречникова**, ***, Б. Б. Кузнецов***, Д. Ю. Сорокин*, ****
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Кафедра микробиологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова ***Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва ****Department of Biotechnology, TUDelft, Delft, The Netherlands Поступила в редакцию 14.04.2014 г.
Тестировано значительное количество ранее разработанных методов выделения ДНК из образцов со сложной физико-химической структурой (почв, илов, осадков) и предложенных в данной работе модификаций этих методов. Оценена их пригодность для выделения ДНК из образцов осадков гиперсоленых содовых озер Кулундинской степи, и разработана наиболее эффективная модификация непрямого (двухэтапного) метода выделения ДНК. При этом показано практически полное отделение клеточной фракции из исследуемых образцов, и, вместе с тем, неэффективность применения вложенной ПЦР для использовании в анализе клоновых библиотек, полученных из отмытых осадков на основании амплификации фрагментов генов 16S рРНК. В то же время, на основании анализа клоновых библиотек, полученных из отделенной клеточной фракции из образцов стратифицированных (верхнего, среднего и нижнего слоев) осадков, было показано, что большинство филотипов эубактерий осадков содового озера Горчина-3 относятся к классу Clostridia филума Firmicutes и, возможно, являются специфическими для данного местообитания, составляя новый, неизвестный пока таксон высокого ранга. При этом, из полученных данных следовало, что в прибойной зоне озера Горчина-3 в иловых осадках на глубинах от 0 до 20 см не наблюдается выраженной стратификации видового разнообразия эубактериального компонента микробного сообщества.
Ключевые слова: соленые и содовые озера, выделение ДНК, гены 16S рРНК.
DOI: 10.7868/S0026365614060196
Содовые озера являются уникальными экосистемами с двойными экстремальными условиями: высокой карбонатной щелочностью в растворе, обеспечивающей стабильно экстремально высокий pH в районе 10, и высокой соленостью [1]. Такие условия способствуют доминированию прокариотной компоненты в составе галоалкало-фильного микробного сообщества. В экстремальных условиях нередко обнаруживаются уникальные автохтонные микроорганизмы, не встречающиеся в других экосистемах, что говорит об актуальности изучения биоразнообразия таких местообитаний. Кроме того, изучение функциональной структуры микробных сообществ содовых озер дает новые сведения о границах устойчивости микробных сообществ в экстремальных условиях.
Исследованию структуры галоалкалофильных микробных сообществ различных содовых озер посвящено большое количество работ. Эти работы позволили выявить, что в таких озерах функци-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: tptour@rambler.ru).
онирует полноценная система, осуществляющая все базовые элементные циклы и представленная основными филогенетическими ветвями прокариот [1—5]. Однако в большинстве этих работ были исследованы слабо или умеренно минерализованные озера, поэтому особенности этих процессов в экстремально галоалкалофильных условиях и характеристики микроорганизмов, их осуществляющих, исследованы пока недостаточно и могут заметно отличаться от уже изученных.
Для изучения разнообразия прокариот в соленых и содовых озерах использовались не только традиционные культуральные методы, но и моле-кулярно-биологические методы, основанные, в первую очередь, на ПЦР-амплификации и создании библиотек клонов генов 16S рРНК. Этот метод, в частности, использовался при изучении системы содовых озер Wadi An Natrun в Египте [6], Внутренней Монголии в Китае [7] и содового озера Mono Lake в США [8]. Недавно было проведено исследование сообществ содовых озер Эфио-
Таблица 1. Характеристика содовых озер, образцы осадков которых использованы для отработки методики выделения ДНК и анализа библиотек клонов генов 168 рРНК
Озеро Обозначе- рН Соленость, Описание Фитобиомасса
ние г/л Рассол Осадок
Петухово 1K1 9.80 200 Зеленый Черный песок Много разлагающихся С1айоркога и отмирающих АНвт1а
Горчина-1 2K1 10.23 400 Маслянисто-желтый Черный ил Очень тонкие цианобак-териальные биопленки под солевой коркой
Горчина-3 3KL 9.90 200 Зеленый Розоватая глина Много отмирающих С1айоркога
Танатар-6 4KL 9.80 250 Зеленый Серая глина Много эукариотических водорослей, в основном БышаИвИа
Танатар-3 5KL 9.85 100 Прозрачный Черный песок Нет; много АНвт1а
Танатар — трона, кристаллизующийся водоем 6KL 9.60 380 Коричневый Черный песок Нет; цвет, вероятно, определяется наличием натроноархей
Примечание. Серым выделен образец, использованный для анализа библиотек клонов генов 168 рРНК.
пии с использованием высокопродуктивного пи-росеквенирования [9].
Бактериальные сообщества осадков нескольких содовых озер Кулундинской степи (Алтайский край) были изучены в единственной работе [10], в которой с помощью амплификации и денатурирующего градиентного гель-электрофореза ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК было показано, что филогенетическое разнообразие бактерий в содовых озерах зависит от степени солености озер.
Распределение различных физиологических групп микроорганизмов в природных местообитаниях неравномерно и определяется физико-химическими параметрами окружающей среды — освещенностью, содержанием кислорода и других соединений, температурой и т.д. Однако лишь единичные работы посвящены изучению стратификации микробных сообществ в содовых озерах. В частности, из данных по вертикальному распределению микроорганизмов в различных слоях водной толщи озера Mono Lake, следует, что состав микробных сообществ миксолимниона и оксиклина почти не различаются и существенно беднее, чем в анаэробном и более соленом мони-молимнионе и хемоклине, причем ни один из обитателей монимолимниона не был обнаружен в оксиклине и выше [8].
Целью настоящей работы являлось исследование видового разнообразия бактериального сообщества стратифицированных иловых осадков содового озера Горчина-3 в Кулундинской степи с использованием гена 16S рРНК в качестве молекулярного маркера.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика использованных образцов. Образцы осадков из различных гиперсоленых щелочных (содовых) озер Кулундинской степи (Алтай, Россия) были отобраны в июле 2012 г. Общая характеристика озер и образцов представлена в табл. 1. Пробы осадков с придонными рассолами отбирали из ненарушенных колонок, получаемых с помощью донного пробоотборника. Как правило, отбирали образцы 3-х слоев: поверхностного верхнего аэробного с придонной водой (с1), среднего 5—10 см (с2) и нижнего слоя 10—20 см (с3). В лаборатории 10 см3 образца осадка суспендировали в 50 мл 1 М №С1, и после гомогенизации в несколько приемов удаляли грубые фракции с помощью низкоскоростного центрифугирования. Коллоидную фракцию концентрировали, еще раз промывали рассолом, и в итоге получали дублированный образец около 0.5 см3, который хранили в замороженном состоянии при —80°С до выделения ДНК.
Выеделение ДНК. Использованный ранее [11, 12] для аналогичных образцов метод выделения ДНК (МоВю) оказался эффективным только для части вновь полученных образцов, по-видимому, из-за экстремального повышения уровня солености озер в 2012 году. Поэтому были проведены эксперименты с использованием различных наборов буферов и реактивов для оптимизации метода выделения ДНК из вновь полученных образцов. Степень эффективности сравниваемых вариантов метода выделения ДНК оценивали по результатам проведения ПЦР с универсальными
праймерами на гены 16S рРНК. Были применены следующие методы:
1) щелочной лизис с додецилсульфатом натрия и очистка по системе Wizard Plus Minipreps DNA Purification System ("Promega");
2) метод выделения ДНК из образцов почв с использованием набора реактивов MoBio Power Soil DNA Isolation kit ("MoBio Laboratories", США);
3) непрямой метод — отделение клеток буфером с поливинилпирролидоном;
4) растворение силикатов с помощью щелочи и очистка с применением набора реактивов MoBio Power Soil DNA Isolation kit по [13];
5) лизис с протеиназой К и SDS в буфере, содержащем активированный уголь, ПВП, цетилт-риметиламмония бромид (CTAB), осаждение по-лиэтиленгликолем по [14];
6) растирание в жидком азоте со стеклянной пылью (буфер с хелаторами и неионным детергентом), лизис с протеиназой и SDS, CTAB, очистка;
7) предварительная обработка смесью гексан/ диэтиловый эфир (1/1); выделение по методу 5), очистка на колонке с Sephadex G-50;
8) лизис с протеиназой К и SDS, обработка ультразвуком, сорбция ДНК на MagneSil® Paramagnetic Particles ("Promega"), промывание гуанидин тиоцианатом и этанолом, очистка хлороформом, очистка на колонке с Sephadex G-50;
9) лизис с протеиназой К и SDS, сорбция на сорбенте Wizard MaxiPreps DNA Purification Resin ("Promega", США), промывание GuHSCN и этанолом на миниколонке, дальнейшая очистка элю-ата после миниколонки хлороформом и дальнейшая очистка на колонке с Sephadex G-50;
10) новый комплексный двухэтапный метод, сочетающий прямой и непрямой способы выделения ДНК. Новый метод включал:
I-й этап — отделение клеточной фракции. Навеску образца суспендировали в буфере следующего состава (в пропорции 400 мкл буфера на 100 мг образца): 1.5 M NaCl, 0.1 M Na-фосфатный буфер (pH 8.0), 1% PVP, 1% Triton X100, 50 мM EDTA. Инкубировали 50 минут на качалке (250 об/мин), осаждали ил, супернатант отбирали и помещали в холодильник. К осадку добавляли буфер в пропорции 200 мкл на 100 мг, инкубировали на качалке 15 мин. Осаждали ил, супернатант добавляли к предыдущему и повторяли суспендирование. Объединенные супернатанты подвергали дифференциальному центрифугированию — осаждали частицы почвы при 5000 g, затем при 18000 g осаждали клетки. ДНК из клеток выделяли стандартным методом (лизис 1% SDS в 0.2 М NaCl при 65°C с РНКазой, осаждение SDS с ацетатом K и сорбция на смоле Wizard Maxipreps DN
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.