УДК 577.29
ИССЛЕДОВАНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ РАФТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ © 2014 г. М. Е. Боздаганян*, К. В. Шайтан
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73; *электронная почта: m.bozdaganyan@gmail.com Поступила в редакцию 21.01.2014 г.
Формирование рафтов было исследовано с использованием метода молекулярной динамики. Модельные мембраны состояли из липидов трех типов: холестерина (ХОЛ), В-эритро-п-пальмитоил-сфингомиелина (СМ) и 1-пальмитоил-2-олеоил-зп-глицеро-3-фосфатидилхолина (ПОФХ). В первой моделируемой системе была создана область, обогащенная СМ и ХОЛ, которая, как показано, с течением времени становится толще, чем ПОФХ-содержащая мембрана, а также переходит из фазы в Ьс. Во второй моделируемой системе — кубической ячейке с водой и СМ, ХОЛ и ПОФХ — сформировался бислой без рафта, где все липиды оказались в Ьс-фазе. В третьей системе — случайно расположенные липиды в бислое — наблюдали образование рафта в мембране общей площадью 72 нм2 с повышенным содержанием молекул СМ и ХОЛ по сравнению с остальной мембраной.
Ключевые слова: молекулярная динамика, рафт, холестерин, сфингомиелин.
DOI: 10.7868/S0233475514040033
ВВЕДЕНИЕ
Понимание структуры и роли мембраны в клетке значительно развилось после введения классической жидкомозаичной модели Сингера и Николсона [1]. Позже жидкомозаичная модель мембраны была переработана, дополнена и значительно усложнена [2]. Большое количество экспериментальных данных указывает на то, что в модельных мембранах есть наноразмерные выступающие области, обогащенные сфингомиели-ном (СМ) и холестерином (ХОЛ), — "рафты", которые, возможно, играют важную роль в функциональной активности клетки: в процессах мембранного транспорта, передачи сигнала, регуляции активности мембранных белков [3—5]. Однако существование стабильных рафтов в клеточных мембранах в настоящее время подвергается сомнению некоторыми авторами [6]. С другой стороны, если рафты в клеточных мембранах существуют хотя бы в динамичном режиме, то они в настоящее время не могут исследоваться экспериментальными методами, поскольку имеют очень малые размеры и быструю динамику. Отметим, что в пользу наличия рафтов в мембранах in vivo свидетельствуют результаты опытов по регистрации движения мембранных белков на отдельных участках мембран [6]. Кроме того, существование рафтов подтверждается неравномерным распределением флуоресцентных зондов
(например, 6 -д од еканоил- 2-диметиламинонаф-талина) в мембранных средах, оцененным при помощи двухфотонного лазерного микроскопа с измерением обобщенной поляризации мембран [7]. Однако определение физических свойств рафтов (размеры, время жизни, точный липидный состав) в живых клетках затруднено [8, 9].
Следует также учитывать, что биологические мембраны имеют сложный и разнообразный липидный состав. Поэтому необходимо изучать набор различных модельных бислоев, чтобы понять роль отдельных липидов мембранных доменов. Обычно модели бислоев содержат лишь два или три вида липидов [9, 10]. В этих мембранах сосуществуют жидкая упорядоченная (Ьс) и жидкая неупорядоченная (Ьй) фазы [11, 12]. Ьй-фаза значительно обогащена ненасыщенными фосфати-дилхолинами, в то время как Ьс-фаза обогащена смесью СМ и ХОЛ. Наиболее ярким визуальным свидетельством формирования доменов в мембранах могут служить эксперименты по флуоресцентной микроскопии ленгмюровских пленок смешанных фосфолипид/ХОЛ [13-16] и СМ/ХОЛ монослоев [17, 18]. В ленгмюровской пленке при различных концентрациях ХОЛ в смеси наблюдаются микронные области, обогащенные ХОЛ, и области практически без ХОЛ. По данным ЯМР-анализа, в смеси ХОЛ, СМ и 1-пальмитоил-2-олеоил-от-глицеро-З-фосфатидилхолина (ПОФХ)
(1 : 1 : 1) происходит быстрый обмен ХОЛ между двумя фазами мембраны [19], что ставит под сомнение существование устойчивых нанодоменов в такой системе. С помощью методов рассеяния рентгеновских лучей и калориметрии [20] определены структурные и калориметрические свойства СМ-бислоев, охарактеризованы параметры взаимодействий СМ с ХОЛ и с ненасыщенными фос-фолипидами.
Толщина бислоя рафтовой фазы превышает толщину окружающей мембраны. Методами атом-но-силовой микроскопии исследован бислой, состоящий из 1,2-дипальмитоил-5я-глицеро-3-фосфатидилхолина (ДПФХ), СМ и ХОЛ, взятых в разных концентрациях [21]. В этих мембранах существуют области размером 10—100 нм, обогащенные ДПФХ/СМ, а при добавлении ХОЛ (25% и выше) размер доменов увеличивался до 500 нм. При концентрации ХОЛ 30 и 50% домены возвышаются над окружающей мембраной на 0.6 и 0.4 нм соответственно.
Согласно современным представлениям, раф-ты в биологических мембранах имеют флуктуирующую природу и представляют собой гранулированные структуры нанометровых размеров и различного состава [9, 22—25]. Известно, что ХОЛ играет важную роль в стабилизации рафта. В присутствии ХОЛ параметр порядка ацильных цепей повышается, уменьшается площадь, приходящаяся на липид, а, следовательно, увеличивается плотность упаковки липидных молекул [26—28]. Кроме того, ХОЛ заполняет свободное пространство в области ацильных цепей липидов [26]. При увеличении концентрации ХОЛ возрастает жесткость изгиба мембраны. Тем не менее коэффициент латеральной диффузии Ьс-фазы уменьшается не более чем в 2—3 раза по сравнению с Ьа-фазой, которая также имеет в своем составе ХОЛ [6]. Кроме того, молекулярное моделирование показывает, что в зависимости от концентрации ХОЛ меняется профиль латерального давления мембран: от плоской формы до чередующихся областей с большим положительным и отрицательным латеральным давлением [29]. Исследование полноатомной модели рафта [30] также показало, что профили давления существенно изменяются в жестких упорядоченных рафтовых областях мембраны. Это может оказаться важным, так как
изменение профиля латерального давления существенно влияет на структуру и активность некоторых белков [30, 31], в частности, механочувстви-тельных каналов.
Отметим, что относительно небольшие размеры рафтов (порядка нескольких нанометров [32, 33]) позволяют исследовать их методами компьютерного моделирования. Однако изучение рафтов методами молекулярной динамики (МД) применяется относительно редко [30, 34, 35]. Как правило, интерес вызывает структура агрегатов из небольшого числа липидов, а процессы формирования рафтовых областей не рассматривают.
В представленной работе акцент сделан именно на исследовании методом молекулярной динамики (в тяжелоатомном приближении) процессов формирования рафтов. Изучаемые мембраны содержали липиды трех типов: ПОФХ, ХОЛ и СМ. Изучена динамика поведения трех систем: сформированной и встроенной в мембрану области, обогащенной СМ и ХОЛ (система А); неупо-рядоченых липидов в боксе с водой и формирование бислоя из них (система Б); бислоя со случайным распределением липидов и формирование рафта в нем (система В). Основное внимание было уделено таким характеристикам мембранных структур, как размер, толщина, коэффициенты диффузии липидов, параметры порядка ациль-ных цепей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Во всех численных экспериментах использовали силовое поле GROMOS, модель воды — TIP3P. Расчет траекторий проводили в NPT-ан-самбле при температуре 323 К (ланжевеновская динамика) и баростатом Нозе—Гувера (изотропное давление — все компоненты давления 1 бар). Программный пакет для МД — Gromacs 4.6. Для потенциалов Леннарда—Джонса радиус обрезания составлял 1.2 нм, для расчета электростатических взаимодействий использовали метод PME. Шаг интегрирования — 2 фс, длина траекторий — не менее 300 нс. Основные характеристики модельных систем приведены в табл. 1. Соотношение ПОФХ : ХОЛ : СМ во всех системах составило 2 : 1 : 1 [36].
Таблица 1. Характеристика исследуемых систем
Система Количество молекул липидов Размеры ячейки, нм Количество молекул воды
СМ ХОЛ ПОФХ
А 106 104 268 26 х 5 х 10 34698
Б 106 104 269 12 х 12 х 12 42699
В 123 123 244 28 х 6 х 12 32639
1000
800
г к
ь, 600
т с о
тно
о
400 -
200
9
68 Y, нм
X
20
5 15
10
2
Л
Л
3 3
4 6 Y, нм
Рис. 1. Эволюция свойств системы со случайно расположенными липидами в боксе (система Б). а — Начальная конфигурация системы — перемешанные липиды в кубическом ящике (вода не показана). б — Профиль плотности липидов, воды и системы до (1—5) и после (6—10) образования мембраноподобной структуры: 1, 6 — система, 2, 7 — ПОФХ, 3, 8 — СМ, 4, 9 — ХОЛ, 5, 10 — вода. в — Фрагмент бислоя, сформированного в процессе симуляции — все липиды находятся в фазе г — Плотность атомов фосфора ПОФХ (2), СМ (3) и кислорода ХОЛ (1) в мембране. Все атомы в ли-пидах изображены в виде ван-дер-ваальсовых сфер. ПОФХ изображен белым цветом, СМ — черным цветом, ХОЛ — серым цветом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование бислоя из смеси липидов. Липи-ды случайно распределялись в кубической ячейке объемом 1870 нм3 с водой (рис.1а). Степень гидратации составляла 89 молекул воды на липид. Далее система эволюционировала в соответствии с алгоритмами равновесной молекулярной динамики. В результате наблюдалось формирование бислоя из смеси липидов. Спустя 194 нс появля-
ется мембраноподобная структура (рис. 1в), которая сохраняет свою конфигурацию до конца расчета (371 нс), имеется некоторая асимметричность мембраны.
Профили плотности системы характеризуют распределение атомов или молекул в расчетной ячейке вдоль определенной координаты, т.е. нулевая плотность в данной точке означает, что искомых атомов или молекул нет. Толщина бислоя рассчитывалась из плотностей атомов фосфора
0
5
0
О К
С4
1
2 3
4 5
1 1 1 1 6 | |
10 15 20 Время, нс
25
30
0.25
^ 0.20 со
&
е м
св
р
св
с
0.15
0.10
0.05
4 6 8 10 12 Номер атома углерода
14 16
Рис. 2. СКО и параметры порядка ацильных цепей липидов для системы со случайно расположенными липидами в боксе (система Б). а — СКО для молекул липидов в плоскости хг в начале симуляции (сплошные линии 1—3): 1 — ПОФХ, 2 — СМ, 3 — ХОЛ, и в конце симуляции (прерывистые линии 4—6): 4 — ПОФХ, 5 —
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.