ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2012, том 31, № 11, с. 8-13
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ
УДК 577.34
ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ КОНФОРМАЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ СПИН-МЕЧЕННОГО РЕГЕНЕРИРОВАННОГО РОДОПСИНА МЕТОДОМ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ © 2012 г. П. В. Шелякин, А. Л. Коварский, В. В. Каспаров, Т. Б. Фельдман, М. А. Островский
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва
E-mail: diomedea@yandex.ru Поступила в редакцию 26.09.2011
Методом спектроскопии ЭПР с переносом насыщения проведено исследование фотоиндуцирован-ных конформационных изменений спин-меченного (Cys140 и Cys316) родопсина в составе фоторе-цепторной мембраны. При освещении родопсина "желтым" светом (к > 450 нм), переводящим его из темновой формы в физиологически активную форму метародопсина II, подвижность цитоплаз-матической петли (Cys140) и восьмой альфа-спирали (Cys316) возрастает, а при последующем освещении "синим" светом (к < 445 нм), переводящим метародопсин II в смесь неактивных фотореге-нерированных продуктов, подвижность снижается. Продемонстрировано восстановление особенностей фотоиндуцированных изменений конформационной подвижности цитоплазматических петель регенерированного в темноте родопсина.
Ключевые слова: родопсин, ЭПР-спектроскопия спиновых меток, фотоиндуцированные конформа-ционные изменения.
ВВЕДЕНИЕ
Спиновые метки, ковалентно связанные с 8И-группами цистеиновых аминокислотных остатков светочувствительного зрительного пигмента родопсина, успешно применяются для исследования структуры и конформационной динамики как этого, так и многих других мембранных белков.
Используя метод ЭПР-спектроскопии с переносом СВЧ-насыщения [1, 2] и два типа малеи-мидных спиновых меток — "коротких" и "длинных", мы в середине 80-х годов впервые зарегистрировали в работе [3] увеличение вращательной подвижности этих меток при действии видимого света на родопсин в составе фоторецепторной мембраны. В этом эксперименте спиновые метки были присоединены к доступным цистеиновым остаткам Су8140 и Су8316, поведение которых отражает неспецифические структурные перестройки в цитоплазматической области третьего трансмембранного "тяжа" (ТМ3) и восьмой альфа-спирали (И8), лежащей параллельно плоскости фоторецепторной мембраны.
Этот результат был интерпретирован нами как увеличение конформационной подвижности ци-топлазматического домена родопсина на стадии его перехода в физиологически активную форму — сравнительно долгоживущий промежуточный продукт фотолиза родопсина — метародопсин II, способный связывать и активировать следующий
белок ферментативного усилительного каскада фототрансдукции — О-белок (трансдуцин).
Последующие многочисленные исследования, выполненные с помощью метода ЭПР-спектро-скопии спиновых меток [4, 5], наряду с целым рядом других физических методов позволили подробно описать структуру и конформационную динамику гидрофильных (цитоплазматического и экстраклеточного) и гидрофобных (трансмембранных) доменов молекулы родопсина в темно-вом состоянии и после поглощения им видимого света [6].
В той же работе [3] со спин-меченым цистеи-новыми остатками Су8140 и Су8316 нами было показано, что при повторном действии синего света в полосе поглощения метародопсина II наблюдается уменьшение подвижности спиновой метки. Этот результат был интерпретирован нами как фотообратимое конформационное изменение родопсина, приводящее к уменьшению доступности активного центра к связыванию с О-белком, и демонстрировал не только спектральную, но и конформационую фоторегенерацию (фотообратимоть) зрительного пигмента.
Следует отметить, что если фоторегенерация зрительных пигментов для позвоночных животных и человека не является физиологически значимым процессом (для них характерен темновой, многокомпонентный биохимический путь регенерации), то для большинства беспозвоночных
(членистоногих, головоногих) фоторегенерация — естественный процесс. Она происходит в результате поглощения метародопсином кванта света, который переводит хромофор обратно из транс- в 11-цис-конфигурацию.
Что касается темновой регенерации родопсина — классического G-белок-связывающего рецептора, то схематически она выглядит следующим образом. Опсин — апо-белок молекулы родопсина обладает исключительно низкой G-белок-связывающей активностью [7]. Встраивание и ковалентное связывание 11-цис-ретиналя в хромофорном центре опсина приводит к образованию (регенерации) родопсина, в котором 11-цис-ретиналь выполняет одновременно функцию и хромофорной группы, и мощного лиганда-антагониста (inverse agonist). Благодаря этому родопсин как G-белок-связывающей рецептор в темновом состоянии полностью неактивен. Как показывает молекулярное моделирование, в ходе встраивания ("адаптации") 11-цис-ретиналя в хромофорный центр, амплитуда флук-туаций цитоплазматических петель снижается, что может быть интерпретировано как уменьшение их подвижности и повышение недоступности для связывания опсина с трансдуцином и другими белками [8].
Фотоизомеризация связанного 11-цис-ретина-ля в транс-форму инициирует образование сначала короткоживущих промежуточных продуктов, а затем — сравнительно долгоживущего (миллисекунды) метародопсина II (Xmax = 380 нм). Метародопсин II является физиологически активной формой родопсина как G-белок-связыва-ющего рецептора, в котором полностью транс-ретиналь играет роль мощного лиганда-агониста [9]. Последующий разрыв ковалентной связи и высвобождение полностью транс-ретиналя приводят к образованию свободного опсина. Происходящие в ходе регенерации родопсина встраивание нового 11-цис-ретиналя в хромофорный центр и его ковалентное связывание с 296-ым остатком лизина приводят к восстановлению как спектра поглощения, так и конформационного состояния молекулы зрительного пигмента.
Если восстановление спектра поглощения родопсина при регенерации было показано еще Дж. Уолдом с сотр. в 50-х годах, то вполне ожидаемое восстановление конформационного состояния белковой части продемонстрировано не было. Более того, как было показано в работе [10], спектральные характеристики хромофорного центра и конформационные изменения в опсине не всегда могут быть сопряжены. Поэтому представляло интерес продемонстрировать восстановление кон-формационного состояния регенерированного в темноте родопсина, а именно восстановление фо-тоиндуцированной конформационной подвижно-
сти спин-меченых цитоплазматической петли (Cys140) и восьмой альфа-спирали (Cys316).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод получения фоторецепторных дисков, содержащих зрительный пигмент родопсин. Все стадии выделения белка проводились в полной темноте, или при тусклом красном свете. Фоторецеп-торные диски, содержащие родопсин, получали из сетчатки глаз быка (Bos taurus) по модифицированной методике Окады [11].
Модификация родопсина спиновыми метками. Для модификации молекулы родопсина использовали цистеин-специфичную метку — 1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-малеимидопирролидин (рис. 1). Как было показано в работе [3], при добавлении метки к суспензии фоторецепторных дисков она связывается с тремя разными SH-группами: SH-1, SH-2 и SH-3, причем реакционноспособ-ность этих групп сильно различается (соответствующие константы скоростей реакций: k1 = = (2.3 ± 1.1) • 10-2 с-1, k2 = (1.55 ± 2.3) • 10-3 с-1, k3= (2.36 ± 0.05) • 10-4 с-1). Эти различия позволили нам селективно модифицировать одну или несколько выбранных нами типов SH-групп (до 75% меток связываются с заданной SH-группой). В этой же работе было установлено, что группа SH-2 представляет собой остаток цистеина-316, группа SH-3 — цистеин-140, а группа SH-1 может принадлежать минорным белкам фоторецептор-ной мембраны, обесцвеченному родопсину или одному из цистеинов С-концевого пептида.
В данной работе спиновые метки "сажали" на оба цистеина: 140 и 316 (рис. 1). Для этого осадок, содержащий фоторецепторные диски, ресуспен-дировали в HEPES-буфере (10 мМ HEPES, 0.2 М сахарозы, pH = 7) так, чтобы конечная концентрация белка была 10 мг/мл. Затем в атмосфере аргона добавляли к суспензии спиртовой раствор N-этилмалеимида (НЭМ) из расчета 10 молей НЭМ на 1 моль родопсина (конечная концентрация этилового спирта была не более 2%) и инкубировали смесь в течение 2 мин, тем самым блокируя группы SH-1.
Для прекращения реакции и отмывания родопсина от НЭМ суспензию разбавляли 10-кратным объемом HEPES-буфера, инкубировали 15 мин и центрифугировали (41400g, 30 мин). Полученный осадок вновь ресуспендировали в HEPES-буфере так, чтобы конечная концентрация белка была 10 мг/мл, и в атмосфере аргона добавили в систему спиртовой раствор спиновой метки в 10-кратном молярном избытке (конечная концентрация этилового спирта была не более 2%). После этого система инкубировалась в течение 50 мин. Модифицированный родопсин отмывали от непрореагировавшей спиновой метки
аналогично отмыванию от НЭМ (процедуру отмывания повторяли несколько раз).
Облучение родопсина. Облучение образцов проводили при помощи лампы накаливания в 100 Вт с использованием фильтров ЖС-11 (X > 450 нм, "желтый" свет) и ФС-7 (X < 445 нм, "синий" свет) либо в спектрофотометрической кварцевой кювете, либо непосредственно в резонаторе ЭПР-спектрометра. За ходом обесцвечивания пигмента следили по изменению спектра поглощения на спектрофотометре иУ-1700 фирмы "8Ышаё2и" (Япония).
Темновая регенерация родопсина. Регенерацию родопсина проводили согласно методике, описанной в [12]. К суспензии обесцвеченных фото-рецепторных дисков добавлялся 2-5-кратный молярный избыток 11-цис-ретиналя в диметилсуль-фоксиде — DMSO (конечная концентрация DMSO в смеси составляла не более 2%). После этого смесь инкубировали в течение 15 мин. Качество регенерации оценивали по изменению спектров поглощения, как описано в [12].
ЭПР-спектроскопия. Спектры ЭПР спин-меченого родопсина регистрировали в темноте и после облучения в течение 30—60 с. Регистрация ЭПР-спектров проводилась на ЭПР-спектромет-ре Вгакег ЕМХ 8/2.7 (Германия) в центре магнитной спектроскопии Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН.
Образец в плоской кварцевой кювет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.