МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 295-301
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841:577.214/215
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ ГЕНА твйА2 У МЕТИУЮВАСТЕЯШМ В1СИЮЮМЕТИЖ1СиМ ДМ4
© 2014 г. Ю. Е. Фирсова, Ю. А. Троценко1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 14.11.2013 г.
Исследовали гипотетический ген МеЛу1оЬа^епыт МеМоготеМатсыт ДМ4 МЕТВ12644 (modA2) в составе хромосомного фрагмента (126 т.п.н.), связанного с деградацией дихлорметана (ДХМ). Данный ген предположительно кодирует периплазматическую субстратсвязывающую субъединицу мо-либдатного АВС-транспортера, но также имеет сходство с белками, содержащими консервативный домен ostA и определяющими устойчивость грамотрицательных бактерий к органическим растворителям. Методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) показано, что в клетках, выращенных как на ДХМ, так и на метаноле, присутствуют РНК-транскрипты этого гена. С использованием мобилизуемого суицидного вектора рК18шоЪ получен нокаут-мутант с инактивированным геном МЕТБ12644, нуклеотидная последовательность которого прервана ин-серцией гентамициновой кассеты. Мутант после культивирования на метаноле характеризовался пониженной скоростью роста на ДХМ по сравнению со штаммом ДМ4 дикого типа, причем наблюдаемые различия не исчезали при добавлении молибдата натрия. Полученные результаты свидетельствуют об участии продукта гена МЕТБ12644 в адаптации клеток к деградации ДХМ.
Ключевые слова: аэробные метилобактерии, дихлорметан, modA2.
DOI: 10.7868/S0026365614030069
Дихлорметан (CH2Cl2, ДХМ) — высокотоксичный, канцерогенный и мутагенный поллютант, трудно разлагаемый под воздействием абиотических факторов среды. Аэробные метилобактерии способны минерализовать ДХМ благодаря наличию дихлорметандегалогеназы DcmA, цитоплазма-тического фермента, катализирующего трансформацию CH2Cl2 до формальдегида и двух молекул HCl в реакции, зависимой от восстановленного глу-татиона [1].
Ранее с использованием плазмидного вектора рСМ62 был осуществлен перенос структурного и регуляторного генов ДХМ-дегалогеназы dcmA и dcmR из деструктора Methylobacterium dichlo-romethanicum ДМ4 в Methylobacterium extorquens АМ1 [2]. Данный метилотроф генетически близок к штамму ДМ4, но в отличие от него не растет на ДХМ. Полученные трансформанты экспрессиро-вали DcmA (индуцибельно или конститутивно) на уровне штамма ДМ4, но тем не менее не могли расти на ДХМ как единственном источнике углерода и энергии. Это свидетельствует о том, что в минерализации CH2Cl2 наряду с DcmA участвуют дополнительные белки и гены, которые могут быть вовлечены в процессы транспорта ДХМ,
1 Автор для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
преодоления токсического действия интермедиа-та (S-хлорметилглутатиона) и продуктов дегало-генирования (CH2O и HCl).
На основе секвенирования геномов установлено, что у деструктора ДХМ M. dichloromethanicum ДМ4 ген dcmA находится внутри обширного (126 т.п.н.) фрагмента хромосомы ("ДХМ-остро-ва"), отсутствующего у M. extorquens АМ1 [3]. "ДХМ-остров" мало изучен и представлен, главным образом, гипотетическими генами. В пределах этого участка ДНК особый интерес представляет кластер из трех генов modA2B2C2 (METDI2644-2642), предположительно кодирующих субъединицы молибдатного ABC-транспортера: периплазматический субстратсвя-зывающий белок; интегральный мембранный белок — пермеазу и периферический мембранный белок — АТФазу. Данные нуклеотидные последовательности присутствуют в геноме штамма ДМ4 наряду с генами типичного для представителей рода Methylobacterium транспортера молибдатов (METDI5514, METDI4626, METDI4629), но существенно от них отличаются — идентичность аминокислотных последовательностей всего 35%. Столь невысокий уровень идентичности требует экспериментального подтверждения функции кластера modA2B2C2 как молибдатного ABC-транспортера.
296 ФИРСОВА, ТРОЦЕНКО
Штаммы бактерий и плазмиды
Штамм или плазмида Характеристика Ссылка или источник
Methylobacterium Деструктор ДХМ, ВКМ B-2191 = DSM 6343 [5]
dichloromethanicum ДМ4 штамм дикого типа
modA- Производный ДМ4, Данная работа
modA2::aacC1, Gmr
Methylobacterium extorquens ДМ17 Деструктор ДХМ [6]
Methylorhabdus multivorans ДМ13 Деструктор ДХМ, типовой штамм ВКМ B-2030 [6]
Methylorhabdus multivorans ДМ15 Деструктор ДХМ DSM 21470 [6]
Methylopila helvetica ДМ6 Деструктор ДХМ, типовой штамм [5]
Albibacter methylovorans ДМ10 Деструктор ДХМ, типовой штамм DSM 22840 [6]
Ancylobacter dichloromethanicus ДМ16 Деструктор ДХМ, типовой штамм DSM 21507 [6]
Escherichia coli S17-1 F- thipro recA hsdR [7]
[RP4-2Tc::Mu-Km::Tn7] Tpr Smr
Escherichia coli TOP10 F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) Invitrogen
<$80lacZAM15 AlacX74 recA1 araD139
A(ara-leu) 7697 galU galKrpsL (Strr)
endA1 nupG X-
Плазмиды:
pK18mob Мобилизуемый многоцелевой [8]
вектор, Kmr
p34S-Gm Источник Gm'-кассеты, Apr, Gmr [9]
pmodA pK18mob, содержащий клонированный Данная работа
по сайтам XbaI/HindIII
ген METDI2644 (modA2)
из M. dichloromethanicum ДМ4 (844 п.н.)
pmodA-Gm pmodA, содержащий Gmr-кассету, Данная работа
клонированную по сайтам SphI
из p34S-Gm, в прямой ориентации
Вместе с тем обнаружено, что аминокислотная последовательность гена modA2 имеет сходство с белками, содержащими консервативный домен ostA и определяющими устойчивость грамотрицательных бактерий к органическим растворителям [4]. Соответствующий ген (Иёеп_1702) был найден в геноме другого деструктора ДХМ Hyphomicrobium denitrifi-cans АТСС 5188. В связи с этим выдвинута гипотеза, что кодируемый кластером modA2B2C2 транспортер деструктора ДХМ штамма ДМ4 может участвовать в адаптации бактерий к деградации данного токсичного соединения.
Цель работы — выяснение роли гена modA2 (ЫБТВ12644) M. dichloromethanicum ДМ4 в деградации СИ2С12. Для этого была изучена распространенность данного гена среди деструкторов ДХМ с различными путями С1-ассимиляции и проведен транскрипционный анализ его экспрессии, получен нокаут-мутант и охарактеризована способность последнего к росту на ДХМ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование бактерий и использованные векторы. Использованные в работе штаммы бактерий и плазмиды представлены в таблице. Мети-лобактерии культивировали на минеральной среде "К" с метанолом; Escherichia coli — на среде Лу-рия—Бертани (LB), мутантные штаммы — с добавлением соответствующих антибиотиков, как описано ранее [6, 10].
Филогенетический анализ. Построение укорененного филогенетического дерева на основе анализа аминокислотных последовательностей ModA представителей Proteobacteria, доступных в базе данных NCBI Database Project, производили методом Neighbor-Joining, реализованным в пакете программ TREECON [11].
ПЦР-амплификация и секвенирование. Гены modA2 у деструкторов ДХМ амплифицировали методом ПЦР из геномной ДНК с использованием специфических праймеров 2644for (5'-ggcctcta-gagtgcctaatagcgtcgaccgt-3') и 2644rev (5'-gc-caagctttcaggagccttcgcccggtaa-3') на нуклеотидную
последовательность гена METDI2644 штамма ДМ4. ПЦР осуществляли при помощи амплифи-катора BIO-RAD MJ Mini (США). Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили при помощи наборов Big-Dye® Terminator v1.1 и капиллярного анализатора ABI PRISM ('Applied Biosystems", США).
Анализ экспрессии генов METDI2644 и METDI2643 методом ОТ-ПЦР. Тотальную РНК из клеток M. dichloromethanicum ДМ4, выращенных на минеральной среде "MM" [6], содержащей CH2Cl2 или CH3OH, выделяли с помощью реагента TRIzol ("Invitrogen", США) и обрабатывали ДНКазой ("Thermo Scientific", Литва), согласно инструкциям фирм-производителей. Для контроля отсутствия ДНК в препарате РНК проводили ПЦР с использованием праймеров DRTfor и DRTrev на ген dcmA [6]. При отсутствии амплификации фрагментов ожидаемой длины препарат считали свободным от примеси ДНК. Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы RevertAid™ H Minus ("Thermo Scientific", Литва) по протоколу фирмы-производителя с использованием специфических праймеров modAfor (5'-gcagcgttgtagttgc-gagctt-3') и modArev (5'-gatcgaccttgaacggagcgtt-3') на нуклеотидную последовательность гена METDI2644, а также modBfor (5'-gccggggatgctc-ccaccta-3') и modBrev (5'-gcctcggtggcttcaccgtc-3') на последовательность гена METDI2643. Условия ОТ-ПЦР аналогичны опубликованным ранее [6].
Получение нокаут-мутанта по гену modA2. Выделение геномной и плазмидной ДНК, клонирование ДНК и трансформацию компетентных клеток осуществляли согласно стандартным методикам [12]. Для получения инсерционного мутанта использовали метод двойной гомологичной рекомбинации [6, 13]. Ген modA2 (825 п.н.) из M. dichloromethanicum ДМ4 клонировали в суицидный вектор pK18mob по сайтам рестрикции XbaI и HindIII с помощью праймеров 2644for и 2644rev. В результате была получена плазмида pmodA. Далее в последовательность клонированного гена по сайту рестрикции SphI (473 п.н.) вставили ген устойчивости к гентамицину. Полученным вектором pmodA-Gm трансформировали клетки Escherichia coli S17-1; трансформанты использовали для коньюгации M. dichloromethanicum ДМ4. Трансконъюганты отбирали по устойчивости к гентамицину и чувствительности к ка-намицину. Инсерцию гентамициновой кассеты дополнительно подтверждали, используя ПЦР с праймерами на последовательности, фланкирующие инактивируемый ген.
Культивирование M. dichloromethanicum ДМ4 и мутанта modA- на ДХМ и метаноле. Для изучения динамики роста на ДХМ клетки, выращенные на среде "ММ" с метанолом, осаждали центрифугированием (6000 g, 30 мин) и отмывали дважды
свежей стерильной средой "ММ", содержащей 0.1 мкМ молибдата натрия. Далее клетки ресус-пендировали в этой среде до ОП600 = 0.18 и 50 мл суспензии переносили в 300 мл колбы Эрленмейе-ра. В вариантах с повышенными концентрациями Na2MoO4 (0.8 и 1.6 мкМ) в среду добавляли необходимое количество молибдата из 1 мМ раствора. Мутантный штамм выращивали без антибиотика. Колбы закрывали завинчивающимися крышками с резиновой мембраной ("Precision Sampling Corp.", США), ДХМ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.