НЕИРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 2, с. 125-128
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.352
ИССЛЕДОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И СОЧЕТАННОГО ВЛИЯНИЯ ГИПОТАЛАМО-НЕЙРОГИПОФИЗАРНЫХ ГОРМОНОВ И ЯДА ЗМЕИ (Vipera Lebetina) НА УРОВНИ ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНОВ В КРОВИ И РЯДЕ ОРГАНОВ КРЫС
© 2004 г. Р. М. Срапионян1*, М. А. Бабаян1, М. А. Симонян1, 3. X. Паронян1 , Ж. Г. Абелян1, Ф. М. Саакян1, Б. А. Чавушян2, Р. М. Сулханян2, А. А. Галоян1
1Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна HAH РА, Ереван 2Институт физиологии им. Л.А. Орбели HAH РА, Ереван
В острых экспериментах на ннтактных крысах, подверженных интоксикации ядом (Vipera Lebetina) определено содержание ряда металлопротеинов (МП) про- и антиоксидантного действия (МПД и МАД соответственно) в крови, печени, сердце и мозге. Выявлены характерные при токсикозе сдвиги эндогенных уровней исследуемых МП-регуляторов метаболизма активных форм кислорода. Обнаружено резкое повышение содержания нейтрального цитохрома b558 и ряда других МП в крови, свидетельствующее о развитии окислительного стресса, обусловленного повышением дисбаланса между МПД и МАД. Предварительное введение гипоталамического кардиоактивного комплекса -белок-нейрогормон "С" (БНС) и пролином обогащенного пептида (ПП) предотвращает развитие метаболических нарушений, выявляемых под влиянием яда. Обсуждаются возможные изменения антиоксидантного и прооксидантного статуса в ряде органов под влиянием БНС и ПП при интоксикации змеиным ядом.
Ключевые слова: гипоталамо-нейрогипофизарные гормоны, металлопротеины, окислительный стресс, интоксикация.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы отмечается рост публикаций в исследовании острой нейродегенерации при интоксикации змеиными ядами и ее протекции гормонами [1]. Интерес к ядам объясняется не только выявлением их разрушительных многофункциональных эффектов, но и перспективой использования их компонентов в качестве терапевтических средств с целью предотвращения нейродегенера-тивных процессов токсического происхождения, в частности, посредством воздействия на предшественники ряда гормонов [2]. Примечательно, что в ядах обыкновенной гадюки и гюрзы около 75% протеолитической активности приходится на МП и 25% на сериновые протеиназы. Последние, по общепринятому мнению, также как и фосфоли-пазы, создают локальное капиллярное повреждение, тканевой некроз, вызывают различные коагулирующие и антикоагулирующие воздействия, острую гипотензию [3], а многие геморрагические заболевания тромбоцитарного генеза сопровождаются процессами перекисного окисления липидов в тромбоцитах, протекающими по сво-боднорадикальному пути.
*Адресат для корреспонденции: 375014 Ереван, ул. П. Севака, д. 5/1; e-mail: gaIoyan@sci.am
В аспекте исследования действия гипоталамо-нейрогипофизарных гормонов и ядов при нейро-нальных повреждениях, вызванных интоксикацией змеиными ядами и гемисекцией спинного мозга, представляет значительный интерес нейро-протекторная функция при токсикозах нового ПП, открытого Галояном A.A. и сотр. [4]. Протекторный эффект, по мнению автора, объясняется подавлением активности каспазы-3 и -9 и антиок-сидантным свойством ПП [5]. Кроме того, объяснением феномена иммуномодуляторной функции является факт дифференцировки Т-лимфоцитов и усиления биосинтеза интерлейкина-2 в них под воздействием ПП [6].
Уместно отметить участие ПП, а также БНС в регуляции молекулярных механизмов свертывания крови, в частности их действия на метаболизм известного фермента каскадного механизма -фактора Xa [7]. Как показали наши исследования, БНС и ПП специфично влияют на взаимодействие Ха-фактора и антитромбина (AT) III человека, не только увеличивая количество деградирующих компонентов активированного Ха путем автолиза, но и уменьшая количество свободного Ха и содействуя одновременно модификации AT III, что и доказывает наличие альтернативного пути метаболизма Ха.
В свете сказанного представляет очевидный интерес выяснение участия гормонов и ядов в регуляции МАД и МПД крови и ряда органов, что и явилось целью настоящего исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на 40 белых беспородных крысах-самцах, массой 160-180 г, содержащихся на стандартном пищевом рационе вивария со свободным доступом к корму и воде. Животные были разделены на четыре группы, особи трех опытных групп за сутки до внутримышечного однократного введения яда армянской гюрзы Vipera Lebetina в летальной дозе LD 50, равной 2.9 мг/кг массы тела, получали: группа 1 (n = 10) -препарат БНС в дозе 100 мкг/кг; группа 2 (n = 10) -препарат ПП в дозе 100 мкг/кг; группа 3 (n = 10) -0.9%-ный раствор NaCl в эквивалентном количестве.
Контрольные животные группы 4 (n = 10) получали то же количество 0.9%-ного раствора NaCl без последующего введения яда.
Электрофоретически гомогенный препарат БНС получен по методу Срапионян Р.М. и сотр. [8]. Препарат ПП был получен биотехнологическим способом в отделе биохимии нейрогормонов Института биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА.
Декапитацию животных проводили на 7-е сут под легким эфирным наркозом. Кровь, сердце, печень и мозг животных каждой группы собирали в отдельности, обрабатывая одновременно. Кровь стабилизировали 2%-ным раствором щавелевокислого натрия; ткани после тщательной перфузии гомогенизировали в 0.04 М калий-фосфатном буфере, рН 7.4. Выделение и очистку МПД крови - цитохромов b5 из гемолизата, b558I и b558II из сыворотки крови, b558III, b558IV и нейтрального b558 из мембран эритроцитов, а также МАД - церулоплазмина (ЦП), и трансферрина (ТФ) из сыворотки крови, и супероксиддисмутазу (СОД) и каталазу из растворимой фракции эритроцитов осуществляли по методу Симоняна М.А. и сотр. [9]. В работе использованы следующие методы выделения и очистки МП: ионообменная хроматография на целлюлозах КМ-52, ДЭАЭ-А50 ("Whatman", Англия), гель-фильтрация на сефа-дексах G-75, DE-52, G-100 ("Pharmacia", Швеция), биогелях Р-100 и Р-150 ("Reanal" Венгрия).
Активность СОД и супероксидпродуцирую-щую активность супрола и цитохрома b558III осуществляли нитротетразолиевым синим тестом (НСТ) по методу Nishikimi [10], рассчитав проценты ингибирования или прироста образования формазона (560 нм) при восстановлении НСТ супероксидными радикалами в присутствии СОD, супрола и цитохрома b558III соответственно. Ко-
личество остальных исследуемых МП определяли по величине максимальных оптических поглощений, характерных для цитохромов b5 при 525 нм, b558I-IV при 530 нм, супрола при 430 нм, ЦП при 610 нм, ТФ при 470 нм и цитохрома С при 520 нм.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли методом вариационной статистики Стъюдента-Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полученных результатов выявил в крови крыс группы 3, которым предварительно не были введены гормоны - ПП и БНС, достаточно выраженные изменения в содержании как МАД, так и МПД по сравнению с контролем (табл. 1). Происходящие изменения, в основном, связаны с ощутимым повышением нейтрального цитохрома b558, ТФ и, несколько меньше, супрола
и его O2 -продуцирующей активности. Нетрудно заметить, что при интоксикации змеиным ядом у крыс уровень антиоксидантной защитной системы крови снижен по сравнению с уровнем проок-сидантной системы.
В действиях ПП и БНС группы 1 и 2 на метаболизм МП происходящие изменения проокси-дантной системы, в основном, связаны с повышением эндогенных уровней нейтрального цитохрома b558 и суммарной фракции цитохромов b558I и b558II и одновременным снижением цитохрома b5. Повышение уровня суммарной фракции цитохрома может быть связано с адекватным повышением содержания Н202 в сыворотке крови, где уровень каталазной активности снижен (табл. 1). С другой стороны, не исключается способность цитохромов b558I и b558II нейтрализовывать Н202 [11]. Известно, что наряду с этанолом важным
компонентом системы продуцирования O2 при расщеплении перекисей в условиях in vitro являются сахара как скавенджеры НO -радикалов. Не исключено, что положительный антистрессор-ный регулирующий эффект БНС альтернативно можно объяснить наличием в нем олигосахарид-ного компонента.
Риск повышения образования пероксинитри-та, как известно, значительно возрастает при снижении активности СОД, катализирующей реакцию дисмутации супероксид-анион радикала [12].
Однократная предварительная инъекция БНС и ПП крысам группы 1 и 2 повышает активность СОД по сравнению с группой 3. Под действием ПП и БНС увеличивается также содержание ЦП, что связано с уменьшением уровня меди, повышение содержания которой, как известно, вызывает тяжелые формы неврологической болезни Вильсона [13]. На основании вышесказанного можно
ИССЛЕДОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНОГО И СОЧЕТАННОГО ВЛИЯНИЯ
127
Таблица 1. Влияние ПП, БНС и яда на относительные изменения металлопротеинов (% по сравнению с контролем) в крови, печени, сердце и мозге крыс при остром отравлении змеиным ядом (п = 10, р < 0.005)
Металлопротеины 1* 2* 3*
Кровь
Цитохром Ь5 -17.7 ± 1.3 -35.5 ± 2.4 -26.5 ± 1.9
Цитохромы Ь558 I + Ь558 II +57.1 ± 3.3 +47.0 ± 0.7 +2.4 ± 0.02
Цитохром Ь558 мембран эритроцитов -22.1 ± 1.5 -11.3 ± 1.1 +5.6 ± 0.4
Цитохром Ь558 III -10.2 ± 0.7 +29.1 ± 1.7 +2.0 ± 0.2
Цитохром Ь558 IV -18.5 ± 1.3 -35.4 ± 2.6 -33.9 ± 2.1
Нейтральный цитохром Ь558 +43.4 ± 2.9 + 104.3 ± 8.1 +147.8 ±9.4
Супрол +18.1 ± 1.2 +7.5 ± 0.4 +28.4 ± 2.4
O2 -продуцирующая активность супрола +25.5 ± 2.2 +51.9 ± 4.0 +21.3 ± 2.1
Церулоплазмин -21.4 ± 1.9 -31.5 ± 2.0 -62.3 ± 5.9
Трансферрин +35.7 ± 2.4 + 14.3 ± 1.1 +50.0 ± 4.9
Си^-СОД -18.7 ± 1.4 -39.3 ± 2.7 -54.0 ± 4.2
Каталаза -33.7 ± 2.0 -41.5 ± 2.8 -58.8 ± 5.1
Печень
C^Zn-СОД + Mn-СОД +9.6 ± 0.3 +16.0 ± 1.1 +20.0 ± 1.5
Каталаза +33.2 ± 2.4 +33.4 ± 2.1 -50.0 ± 1.5
Цитохром С -16.7 ± 1.9 -50.0 ± 2.8 -33.4 ± 2.5
Сердце
Си^п-СОД + Mn-СОД -10.8 ± 0.7 -10.8 ± 0.4 -22.4 ± 1.7
Каталаза +30.8 ± 2.5 +2.4 ± 0.3 +17.0 ± 1.2
Цитохром С +20.0 ± 1.4 +60.0 ± 4.7 -40.0 ± 3.2
Мозг
Си^п-СОД + Mn-СОД +1.5 ± 0.1 +39.0 ± 2.9 +28.7 ± 1.8
Каталаза +21.7 ± 2.0 +21.6 ± 2.4 -15.9 ± 1.3
Цитохром С -18.6 ± 1.8 +25.6 ± 2.7 +21.0 ± 1.3
* Группа 1 - введение ПП за 1-е сут до вв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.